223例兒童白血病30種融合基因檢測結果分析

黃倩雯，陳海雷，黃 燕，沈妙娜，劉 勇

中山大學孫逸仙紀念醫院兒科血液室，廣東廣州 510120

兒童白血病在兒童惡性腫瘤中所占比例最高，且發生率呈逐漸上升趨勢[1]。目前采用MICM分型對初診患兒進行實驗室診斷和分型，使白血病的診斷從細胞形態學水平上升到分子生物學水平，不僅對研究白血病發病、復發、耐藥機制和生物學特征有重大意義，而且對指導臨床治療和判斷預后也有實用價值[2]。本研究對223例初發或復發的血液腫瘤患兒進行回顧性分析，以明確30種融合基因篩查在兒童白血病腫瘤中的分布情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2017年5月至2019年4月本院223例初發或復發白血病患兒進行回顧性分析，其中男124例，女99例，年齡1個月至14歲，平均(5.5±3.2)歲。采用實時熒光探針PCR進行融合基因檢測，包括急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)常見的如BCR-ABL1、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、MLL和PML-RARα相關等30種融合基因，見表1。

表1 PCR反應液及融合基因檢測

續表1 PCR反應液及融合基因檢測

1.2方法

1.2.1免疫分型和細胞遺傳學 選取肝素鈉抗凝骨髓2～3 mL，予PBS清洗2遍后進行計數，每管控制細胞數在5×105～1×106個，采用四色直接免疫熒光法標記，包括B系、T系和髓系的常用抗體，如CD3、CD8、CD19、CD20、CD33和CD117等40種，采用流式細胞儀FACSCalibur(美國BD公司)進行標準化檢測。同時進行染色體核型分析和FISH探針分析，包括N-MYC、TCF-PBX1、ETO-AML1、PML-RARα、CBFβ-inc(16)、MLL、BCR-ABL、TEL-AML1、CCND-IgH、ALK和MALT1等。

1.2.2RNA提取及濃度測定 取EDTA抗凝骨髓200 μL，按照TIANGEN醫藥有限公司的RNA提取試劑盒說明書進行總RNA提取，使用nanodrop測定RNA濃度，其A260/A280應在1.9～2.1，A260/A230≥2.0，濃度應>0.02 μg/μL。

1.2.3反轉錄 采用廈門至善生物醫藥有限公司的30種白血病相關融合基因試劑提取盒進行檢測，首先將反轉錄試劑及LF Positive Control裂解，然后配制反轉錄體系，將配制好的反轉錄體系按照37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s條件進行反轉錄，反轉錄完畢后，取10 μL反轉錄產物加入40 μL H2O，經該試劑盒中內參檢測Ct值≤30時，該標本RNA的轉錄產物cDNA方可進入后續的融合基因相關檢測。

1.2.4檢測體系配制 取出試劑盒中各種反應液室溫融化，并振蕩混勻后，離心數秒，每個樣品使用A～H 8管PCR mix檢測。根據樣品數量n，分別配制8管mix。取n×19.8 μL mix和n×0.2 μL LF polymerase加到1.5 mL離心管中，振蕩混勻數秒，離心。將配好的A～H 8管mix分別以20 μL分裝于PCR管中。取5 μL稀釋好的樣品或陰、陽性對照cDNA加到每個PCR反應管中，離心數秒。

1.2.5PCR擴增與分析 采用ABI7500儀進行PCR擴增，擴增條件為：預變性50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；Touchdow循環：95 ℃ 20 s，65 ℃ 1 min(每個循環下降1 ℃)，72 ℃ 1 min，10個循環；PCR循環：95 ℃ 20 s，56 ℃ 32 s(4通道采光，FAM、HEX、ROX、Cy5)，72 ℃ 1 min。擴增結束后在擴增曲線界面進行分析。以軟件默認設定3～15個循環的平均熒光信號為基線，在陰性對照無擴增情況下，閾值設定在無擴增曲線樣本的最高點，且以陰性對照未檢出為原則，確定起始閾值。

2 結 果

2.130種融合基因篩選診斷情況 223例初發或復發白血病患兒進行30種融合基因篩選，綜合MICM國際通用的細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學分型標準最終診斷分布為：B-ALL 152例，T-ALL 9例；AML 49例；其他13例，分別為非霍奇金淋巴瘤B系(B-NHL)2例，非霍奇金淋巴瘤T系(T-NHL)1例，混合型急性白血病1例，分類不明急性白血病2例，幼年型粒單核細胞白血病(JMML)1例，慢性粒細胞白血病轉AML1例，慢性粒細胞白血病(CML)5例。

2.2融合基因陽性分布特點 223例患兒中融合基因陽性率為43.0%(96/223)，其中B-ALL陽性率為32.2%(49/152)，T-ALL陽性率為22.2%(2/9)；AML陽性率為75.5%(37/49)；其他病例陽性率為61.5%(8/13)。ALL中最常見的融合基因陽性率分別為：TEL-AML1 15.5%(25/161，BCR-ABL1 4.3%(7/161)，E2A-PBX1 3.7%(6/161)，AML-MTG16 1.9%(3/161)，MLL-AF4、MLL-AF10、MLL-ENL、TLS-ERG、MLL-AF6均為1.2%(2/161)；AML中最常見的融合基因陽性率分別為：AML1-ETO20.4%(10/49)，PML-RARα16.3%(8/49)，CBFβ-MYH11 10.2%(5/49)，DEK-CAN6.1%(3/49)，MLL-AF10 8.2%(4/49)，MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF1p、NPM-MLF、TEL-ABL、SET-CAN、BCR-ABL1均為2.0%(1/49)。SIL-TAL1見于B-ALL，而MLL-AF4和MLL-AF10在ALL和AML中均可出現。

2.3融合基因與免疫分型的關系 分別選取本研究中ALL和AML最常見的兩種融合基因TEL-AML1和AML1-ETO，對其免疫分表型進行分析發現，24例TEL-AML1陽性病例中有22例免疫表型為com-B-ALL,僅2例為Pre-B-ALL，共同特點為CD45陰性，TdT陽性，無跨系表達；10例AML1-ETO陽性病例中有2例伴CD19跨系表達。

2.4融合基因與染色體核型分析和熒光原位雜交(FISH)的結果比較 96例融合基因陽性患兒同時進行染色體和FISH檢測，染色體結果為異常核型43例，正常核型35例，另外18例因無分裂象等原因無結果；而FISH結果中58例異常，26例正常，12例無結果。在共同陽性的病例中，3種方法學融合基因和易位結果均一致。

3 討 論

過去幾十年，通過建立白血病危險因素和研究其生物學機制，兒童整個生存期已大為改善，分子遺傳學從基因途徑提供了有益信息。大部分白血病存在染色體結構異常，包括缺失、重復、倒位、易位等，導致原癌基因及抑癌基因結構變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產生新的融合基因，編碼融合蛋白。有些基因是調控細胞增殖、分化和凋亡的轉錄因子，當基因發生變異時，產生白血病表型，直接影響下游信號傳遞途徑，導致細胞增殖能力增強、凋亡障礙、分化障礙等[3]。

有文獻報道，約有85%的兒童白血病可檢測出克隆型染色體異常，其中平衡性易位最為常見，并導致融合基因產生，融合基因特定易位的存在已證實在白血病的惡性轉化過程中起重要作用[4]。融合基因的檢測有助于兒童白血病的危險分層，判斷預后，并有助于選擇合適的化療方案。兒童急性淋巴細胞性白血病中，最常見的是t(12；21)(p13；q22)染色體易位，形成融合基因TEL-AML1，其余較常見的如t(4；11)(q21；q23)染色體易位，形成MLL-AF4,嬰兒白血病發生率達60%以上[5]；t(1；19)(q23；p13)染色體易位形成E2A-PBX1，檢出率為5.8%[6]；t(9；22)(q34；q11)染色體易位形成BCR-ABL1，檢出率為3%～5%[7]。有研究表明，E2A-PBX1、BCR-ABL1與MLL-AF4轉歸類似，多數預后較差，并與疾病初診時的高白細胞計數和年齡偏大相關[8]。

根據文獻報道，MLL融合基因的多樣化是由于MLL伙伴基因可與30多種不同基因發生融合，常見的兩種MLL融合基因AF9和AF4在ALL和AML中均可發現，其中AF9常見于白血病M4、M5型，偶見于M1、M2型[9]。本研究中融合基因AF4和AF10陽性率較AF9高，且在ALL和AML中均有發生，AF9陽性只見于1例診斷為M4的患者中。MLL-AF10在ALL和AML中均有發生，其發病機制少見報道。TLS-ERG融合基因為較罕見的融合基因之一，在ALL和AML患兒中均可發生，根據北京兒童醫院血液腫瘤中心統計數據顯示,該融合基因在兒童新診治的白血病中發生率僅為0.7%，對于ALL患兒的治療及預后影響不大，但伴有TLS-ERG融合基因的AML患兒治療困難，預后較差[10]。90%以上的CML患者存在Ph染色體及BCR-ABL1融合基因，治療關鍵在于慢性期是否能獲得分子水平的緩解，以甲磺酸伊馬替尼為代謝的酪氨酸激酶抑制劑，是CML的一線治療藥物[11]。

國外文獻報道，AML1-ETO常常伴有CD19表達[12]，本研究24例TEL-AML1病例中其免疫表型22例為com-B-ALL，且CD45陰性，TdT陽性，說明該融合基因可能僅出現在白血病的某一分化階段；而AML1-ETO常常伴有CD19的表達，與文獻[12]報道一致，因此通過確認免疫分型的結果可預判推測某種融合基因陽性。

綜上所述，融合基因對白血病的診斷、鑒別診斷及危險分層、預后評估、靶向治療均有重要指導意義，重視并加強對白血病30種融合基因的檢測，有助于提高兒童白血病的診治水平。