靈桿菌核酸酶重組表達工藝研究

韓爍 陶曉莎 黃鵬 劉慶偉 姜亮

【摘要】目的：優化靈桿菌核酸酶（NU）工程菌pET3c-NU/BL21STAR（DE3）pLysS 30L發酵罐培養及表達條件。方法：上罐發酵采用M9-YT-Glu發酵培養基，IPTG誘導;通過還原SDS-PAGE法測定目標蛋白表達量，RP-HPLC法測定乙酸殘留量，以確定表達溫度、時間等參數。結果：與討論]NU重組菌誘導溫度為30℃、加入終濃度0.2M IPTG誘導，維持誘導時間4hr，目的蛋白表達量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續rNU融合蛋白純化奠定了基礎。

【關鍵詞】靈桿菌核酸酶;重組表達;發酵條件優化

【中圖分類號】R543

【文獻標識碼】B

【文章編號】2095-6851（2020）02-045-01

中國分類號 Q786?文獻標識碼 A

在人用預防及治療類生物制品的質量標準中，核酸殘留量是重要指標，直接關系到產品的安全性。在疫苗工業及蛋白質和多糖類工業中，應用靈桿菌核酸酶可將產品中的核酸污染降低至皮克級，目前，該方法已成為通用做法。我國是疫苗使用和生產大國，故靈桿菌核酸酶在生物醫藥產業特別是疫苗生產中具有非常廣闊的應用市場[1]。

靈桿菌核酸酶是來源于粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens，又稱靈桿菌）的非限制性廣譜核酸酶，可在核酸鏈內的任意核苷酸間進行切割，并可切割任意形式的核酸。其酶切效率遠高于其它核酸酶，活性是牛胰DNase I的34倍，是金黃葡萄球菌核酸酶的6倍[2]。

然而，靈桿菌是一種致病菌，對其大規模培養存在較大風險。目前市場上的主導產品為Merk公司生產的商品名為Benzonase的靈桿菌核酸酶，該產品已通過美國FDA的使用許可，廣泛用于除去生物制品中的核酸，但產量低價格昂貴。國內生產廠家較少，探索靈桿菌核酸酶的規模化生產工藝以滿足醫藥工業的生產要求[3]。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株?pET3c-NU/BL21STAR（DE3）pLysS工程菌由臨沂大學藥學院構建。

1.1.2?培養基?（1）LB液體培養基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，pH 7.0;（2）LB固體培養基：在LB液體培養基中補加1.0%瓊脂;（3）含氨芐青霉素的LB（LA）液體（或固體）培養基：在LB培養基加入氨芐青霉素（100 μg/mL）;（4） M9-YT-Glu發酵培養基：0.5%胰蛋白胨，0.3%酵母提取物，0.06%NaCl， 0.5%KH2PO4，3%Na2HPO412H2O，1%葡萄糖，0.1%MgSO4，0.1%NH4Cl;（5）補料培養基：30%葡萄糖，5%胰蛋白胨，3%酵母提取物。

1.1.3?主要試劑?胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司，中分子量蛋白質Marker購自天根生化科技有限公司，IPTG購自索萊寶，無機鹽、葡萄糖等購自上海生工。

1.1.4?主要儀器設備?HSX-150恒溫恒濕箱，上海申賢恒溫設備廠; HNY恒溫培養振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司;ChampGel 5000數碼凝膠成像分析系統，北京賽智創業科技有限公司;TU-1810紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司;LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司。

1.2?方法

1.2.1?菌密度測定?用紫外可見光光度法測定發酵液600nm波長時光吸收值，以未接種培養基作參比。

1.2.2?目標蛋白表達水平的測定?采用還原SDS-PAGE電泳考馬斯亮蘭染色法，電泳凝膠經掃描后分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。

1.2.3?質粒丟失率的檢測方法?將待測發酵液測OD600值，以無菌水稀釋，使培養液均達到OD600為0.2。然后取200μl涂LB平板，37℃培養48hr。從培養好的LB平板上挑一單菌落同時轉接到LB和LA（含100μg/ml氨芐青霉素）平板上，37℃培養48hr。計算菌落數，LB平板上的菌落數為M，LA平板上的菌落數為N，則丟失率計算方法為（M-N）/M×100%。

1.2.4?乙酸含量測定?（1）乙酸含量測定方法：將待測發酵液離心，收集上清，取500μl上清溶液加入200μl 50%的硫酸溶液，混勻后再加入500μl乙醚溶液，搖勻，離心。取上層溶液10μl通過C18（4.6×250mm）柱，用高效液相色譜法測定其含量，流動相為98% 50mM KH2PO4，2%甲醇，pH2.5;檢測波長210nm;流速1ml/min;時間15min。通過計算乙酸特異吸收峰的峰面積計算待測樣品的乙酸含量。（2）標準曲線的繪制：以冰醋酸溶液為標準，配制0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml，2.0mg/ml，2.5mg/ml六個濃度。分別取500μl上述溶液加入200μl 50%的硫酸溶液，混勻后再加入500μl乙醚溶液，搖勻，離心。取上層溶液10μl 進行含量測定，并制作標準曲線。

1.2.5?工程菌的培養方法（30升發酵罐規格）

（1）種子菌的活化：取-80℃，12.5%甘油保存的生產種子庫菌種，劃線接種于含氨芐（100μg/ml）的LB斜面，37℃培養過夜，挑菌苔于含氨芐（100μg/ml）LB培養基中，37℃，200rpm振搖培養至OD600 為0.4-0.5時，作為活化種子4℃保存。（2）種子液培養：取活化種子，以1：100接種于400ml LB培養基中，30℃，150rpm ，培養15hr，作為一級種子液。再以1：10接種于2L LB培養基的三角瓶中，37℃，250rpm ，培養2hr，作為上罐種子液。（3）發酵工藝：發酵上罐培養基18L，培養基配方為 M9-YT-Glu。取種子液2000ml，加入發酵罐中，使終體積為20L。調整工藝參數：設定溫度37℃，轉速300rpm，pH用50%氨水自動調至7.0。當發酵至3-4hr，開始流加營養液。待菌體OD600達到8-12，溶氧值開始上升時，降溫至30℃，以不同IPTG終濃度（0.1M、0.2M、0.3M ）進行誘導，誘導時間2-6小時，每1小時取1次樣品。樣品離心、作SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達情況。

2?結果與分析

2.1?誘導溫度對蛋白表達的影響

溫度在發酵過程中的影響一方面表現在工程菌產物合成的數量，另一方面表現在工程菌自身數量的增長。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，是使比生長率達到最大值的溫度。將種子液以1：10接入發酵罐中，37℃培養至菌體OD600達到10-12，加入終濃度為0.2M IPTG誘導，同時控制溫度至25℃、30℃、37℃，誘導時間4hr，收集菌體進行SDS-PAGE分析。

如圖1所示，三個溫度均可見明顯目標蛋白表達條帶，其中30℃和25℃對菌體數量增值及表達量明顯優于37℃時表達量;30℃時菌體生長迅速，培養周期短，效率高，綜上，選擇誘導溫度為30℃。

2.2?不同誘導時間對蛋白表達的影響

按上述篩選的發酵工藝進行發酵一次，在不同發酵時間分別取樣測定乙酸含量變化、質粒丟失率以及目的蛋白表達量的關系。

2.2.1?乙酸含量測定方法學研究

如下圖2所示：乙酸還原到發酵液上清后，其保留時間（5.090）與標準品溶液（5.090）完全一致，主峰前后未有明顯雜質峰出現，峰面積回收率98.2%，該方法可用于發酵液上清乙酸殘留量測定

如表1所示，乙酸含量在0.1-2.5mg/ml之間時，含量值與210nm響應值之間線性范圍良好（R2=0.9996），在此范圍可準確測定發酵液上清乙酸殘留量。

2.2.2?不同誘導時間乙酸殘留量及質粒丟失率測定

分別在誘導前和誘導后1hr-6hr取發酵液測定發酵液上清中乙酸的含量，并通過平板培養法計算不同誘導時間的質粒的丟失率。結果如下圖3所示，隨誘導時間的延長，發酵液中乙酸含量呈增加趨勢。在加入誘導劑誘導2小時后，開始漸有質粒丟失，當誘導時間維持至5小時后，質粒丟失率顯著增加。乙酸含量增加嚴重影響質粒穩定性。

3?結論與討論

rNU工程菌的發酵，選擇M9-YT-Glu鹽培養基作為生產發酵培養基，降低溫度為30℃并加入終濃度0.2M IPTG誘導，維持誘導時間4hr，目的蛋白表達量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續rNU融合蛋白純化奠定了基礎。

參考文獻：

[1]?Yang Zhu，et al.The Smart Solution for DNA Removal in Biopharmaceutical Production by Benzonase Endonuclease[J].Applied Virology， 2013， 2（1）：25-33.

[2]?Andrea Balan， et al. A conditional suicide system for Saccharomyces cerevisiae relying on the intracellular production of the Serratia marcescens nuclease [J]. Yeast，2005，22：203-212.

[3]?Shuli Liang， et al. Endogenous signal peptides efficiently mediate the secretion of recombinant proteins in Pichia pastoris [J]. Biotechnol Lett， 2013， 35：97–105.