HILIC-MS/MS測(cè)定牛奶中4種含氮化合物的含量*

SONG HANEUN(宋漢恩)，任 燕

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

三聚氰胺(melamine，MEL)、三聚氰酸(cyanuric acid，CY)、二氰二胺(dicyandiamide，DCD)和尿酸(uric acid，UA)的含氮量如果折合成粗蛋白的含氮量，數(shù)值會(huì)大大增加[1]。牛奶中的蛋白質(zhì)的成分特別復(fù)雜，一般測(cè)定蛋白常用凱氏定氮法，但是這種方法只是檢測(cè)含氮的多少，不能檢測(cè)樣品中是不是含有非蛋白的氮成分。所以一些不法商家常將上述四種物質(zhì)添加到牛奶當(dāng)中，從而使蛋白質(zhì)的含量測(cè)定值上升，嚴(yán)重影響我國(guó)奶制品質(zhì)量安全[2]。但三聚氰胺、三聚氰酸會(huì)引起腎結(jié)石或膀胱結(jié)石等病癥，甚至引起腎衰竭，吸入或者攝入二氰二胺后對(duì)身體有害，而尿酸會(huì)導(dǎo)致人體體液變酸，影響正常細(xì)胞的功能，長(zhǎng)期發(fā)現(xiàn)不了或不治療將會(huì)引發(fā)痛風(fēng)，這四種物質(zhì)均嚴(yán)重危害人們的身體健康[3-5]。牛奶中有可能存在三聚氰胺、三聚氰酸、二氰二胺和尿酸這些非法添加物。為保證牛奶的安全性，同時(shí)檢測(cè)三聚氰胺、三聚氰酸、二氰二胺和尿酸非常必要[1-9]。

目前檢測(cè)這四個(gè)化合物的分析方法很多，包括氣質(zhì)聯(lián)用法[10]、高效液相色譜法[11]等。但尚沒(méi)有對(duì)三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、二氰二胺同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的分析方法。由于三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、二氰二胺的親水性質(zhì)，在普通的反相色譜柱上幾乎無(wú)保留，在不添加任何離子對(duì)試劑的條件下，HILIC柱對(duì)極性物質(zhì)有很好的保留能力，因此本實(shí)驗(yàn)采用親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、二氰二胺的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent Hilic色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；液質(zhì)聯(lián)用儀器(包括島津高效液相色譜儀：檢測(cè)器為SPD-20A，高壓泵LC-20AD，控制器為CMB-20A，柱溫箱為CTO-20A和Applied Biosystems API3200質(zhì)譜儀)；TB-215D電子分析天平，丹佛儀器有限公司；DHG-9423A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；渦旋混合器，美國(guó)Scientific Industries公司；KG-50B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀公司；HH-4數(shù)量恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；TG16-WS合式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心儀器有限公司。

1.2 試 藥

甲醇、乙腈為色譜純；純水；9個(gè)品牌純牛奶。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

親水性色譜柱Agilent Hilic色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相A為純水，流動(dòng)相B為乙腈，恒度洗脫(純水:乙腈=50:50)；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的MRM模式參數(shù)

*定量離子，Δ定性離子。

氣簾氣(Curtain Gas)：10 psi；碰撞氣(Collision Gas)：4 psi；離子噴霧電壓(IonSpray Voltage)正離子：5500 V，負(fù)離子：-4400 V；離子源溫度(turbopray temperature)：550 ℃；霧化氣(Gas 1)：55 psi；加熱氣(Gas 2)：55 psi。標(biāo)準(zhǔn)品的MRM模式參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱取4個(gè)化合物適量，加入50%甲醇溶解，最終配制成三聚氰酸、二氰二胺、尿酸濃度均為4.0 μg/mL、2.0 μg/mL、1.0 μg/mL、0.8 μg/mL、0.4 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL和三聚氰胺濃度20.0 ng/mL、10.0 ng/mL、5.0 ng/mL、4.0 ng/mL、2.0 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。

2.3 供試品溶液制備

分別量取九個(gè)不同品牌的牛奶樣品100 μL，加入甲醇500 μL，渦旋15 s混合均勻，于4500 rpm離心10 min，取上清液于37 ℃下氮?dú)獯蹈伞Ｈ缓蠹尤?0 μL溶劑(甲醇:水=1:1)，超聲3 min，13000 rpm離心10 min。取上清液進(jìn)行分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 樣品專屬性實(shí)驗(yàn)

4個(gè)化合物在“2.1”質(zhì)譜色譜條件下所得的譜圖見(jiàn)圖1，三聚氰胺在正離子模式下檢測(cè)，三聚氰酸、尿酸、二氰二胺在負(fù)離子模式下檢測(cè)。空白溶劑及樣品溶液在“2.1”分析條件下檢測(cè)所得的譜圖見(jiàn)圖2、圖3。結(jié)果表明，空白溶劑不會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定產(chǎn)生影響，該實(shí)驗(yàn)分析方法的專屬性良好。

圖1 二氰二胺(a)、三聚氰酸(b)、三聚氰胺(c)和尿酸(d)的HPLC-MS圖

圖2 二氰二胺(a)、三聚氰酸(b)、三聚氰胺(c) 和尿酸(d)的空白溶劑HPLC-MS圖

圖3 二氰二胺(a)、三聚氰酸(b)、三聚氰胺(c)和尿酸(d)的樣品溶液HPLC-MS圖

2.4.2 Carryover實(shí)驗(yàn)

將4個(gè)化合物的最高定量限的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為4.0 μg/mL，三聚氰胺的濃度為20 ng/mL)進(jìn)行進(jìn)樣，分析完之后立即分析空白溶液。將空白溶液中標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與最低定量限中標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行比較，考察其carryover，其值均小于20%，表明高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的殘留污染不會(huì)對(duì)樣品測(cè)定產(chǎn)生影響。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系

分別以四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，三聚氰胺在濃度范圍0.5～20 ng/mL內(nèi)線性良好，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度范圍均在100～4000 ng/mL內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與R值見(jiàn)表2。

表2 各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.4.4 精密度，重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制4個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為3.2 μg/mL、1.0 μg/mL、0.4 μg/mL，三聚氰胺對(duì)應(yīng)的濃度分別為16.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL，按照“2.1”的分析條件下用于精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的考察。連續(xù)進(jìn)樣6次考察日內(nèi)精密度，隨后連續(xù)三天每天進(jìn)樣6次考察日間精密度考察，配制6份三聚氰酸、二氰二胺、尿酸、三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液重復(fù)性考察，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h共進(jìn)樣8次，根據(jù)色譜峰面積變化來(lái)判斷樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其RSD值均小于15%，說(shuō)明該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

配制4個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為3.2 μg/mL、1.0 μg/mL、0.4 μg/mL，三聚氰胺對(duì)應(yīng)的濃度分別為16.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL，分別將高、中、低三個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白牛奶樣品中，每一水平平行制備6份，檢測(cè)其加樣回收率。結(jié)果測(cè)得三聚氰胺回收率在85.5%～109.0%之間，三聚氰酸回收率在83.8%～109.0%之間，尿酸回收率在88.4%～115.0%之間，二氰二胺回收率在82.5%～115.0%之間，回收率滿足樣品分析的要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率數(shù)據(jù)

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng)

表4 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

A組：配制4個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為3.2 μg/mL、1.0 μg/mL、0.4 μg/mL，三聚氰胺對(duì)應(yīng)的濃度分別為16.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL，高、中、低三個(gè)濃度每個(gè)濃度進(jìn)樣6次，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

B組：分別稱取空白牛奶樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入甲醇500 μL，渦旋15 s混合均勻，于4500 rpm離心10 min，取出上清液，于37 ℃下用氮?dú)獯蹈伞Ｈ缓蠹尤?0 μL 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，渦旋15 s混合均勻，超聲3 min，在13000 rpm高速離心10 min。取上清液進(jìn)樣10 μL，每個(gè)濃度平行6份，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。結(jié)果如表4所示，由表中結(jié)果可以看出樣品的基質(zhì)效應(yīng)均在87.90%～108.0%之間，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 樣品測(cè)定

分別稱取九個(gè)不同品牌的牛奶樣品100 μL，按供試品操作方法進(jìn)行制備，然后進(jìn)行液質(zhì)連用分析。結(jié)果有八個(gè)品牌牛奶中含有尿酸，另外一個(gè)品牌牛奶中未檢測(cè)出任何一種違禁物質(zhì)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.6 陽(yáng)性樣品的結(jié)果確證

為了避免所測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，我們根據(jù)2002/657/EC進(jìn)行判定，2002/657/EC是2008年8月12日被歐盟授權(quán)執(zhí)行關(guān)于分析方法的運(yùn)行和結(jié)果解釋歐盟指令96/23/EC的授權(quán)文件。這一授權(quán)文件中，描述了相對(duì)離子強(qiáng)度最大的允許范圍。

表6 陽(yáng)性樣品峰面積比值

根據(jù)尿酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算求得定性離子/定量離子平均值為88.3%，陽(yáng)性樣品的定性離子/定量離子的比值在≥50%范圍內(nèi)，HPLC-MS/MS允許的誤差范圍為±20%。由表6可知，陽(yáng)性樣品的相對(duì)離子強(qiáng)度偏差都在允許的誤差范圍內(nèi)，確證該實(shí)驗(yàn)所測(cè)樣品結(jié)果為陽(yáng)性結(jié)果。

3 討 論

3.1 色譜柱的選擇

開(kāi)始選用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品由于極性太大，在色譜柱上幾乎不保留，保留時(shí)間比較小，也不能很好地分離。選用親水性的Agilent Hilic色譜柱(4.6×100 mm，3.5 μm)進(jìn)行分析，幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品得到較好的分離，且保留時(shí)間均延后，適于三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸和二氰二胺這些極性化合物的分析。

3.2 流動(dòng)相的選擇

選用乙腈-乙酸水和乙腈-水分別作為流動(dòng)相進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示加入的乙酸會(huì)抑制三聚氰酸負(fù)離子的信號(hào)強(qiáng)度，所以選擇乙腈-水來(lái)作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析。此外分別進(jìn)行了乙腈:水為95:5、90:10、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、10:90、5:95九種不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行分析，最終結(jié)果顯示在乙腈:水為50:50的情況下，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，峰形最美觀，不拖尾，無(wú)雜峰。所以最終選用乙腈:水為50:50作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分析。