微乳色譜法同時測定化妝水中9種防腐劑*

陳燕君，張澤鴻，謝曉琪，羅純娜，彭 程，周 欣

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

近年來，我國化妝品總體消費水平已超歐盟、日本，僅次于美國，成為世界上化妝品消費第二大國。隨著人們消費能力的增強，人們也越來越關注化妝品的使用安全，趙康峰等[1]對8大類化妝品進行急性皮膚刺激性試驗，結果表明各類受試化妝品均出現不同程度的急性皮膚刺激性損害效應。這主要是因為化妝品在生產、使用和保存過程中多種因素都可造成微生物污染，防止化妝品二次污染主要靠添加防腐劑[2-5]，但防腐劑種類繁多且均具一定毒性，過量頻繁接觸會導致人體過敏反應，大多數防腐劑對人皮膚會產生不同程度的刺激[6-9]。因此，監控化妝品中防腐劑的種類和含量尤為重要，我國《化妝品安全技術規范》2015年版規定了51種準用防腐劑的使用限量[10]。

實驗中選取了使用較為廣泛的化妝水進行檢測，目前化妝水中防腐劑測定方法有高效液相色譜法[11-15]、氣相色譜法[16-17]、氣質法[18]、液質法[19]、膠束電動色譜法和毛細管電泳法[20-21]等，以高效液相色譜法為主，但這些方法流動相復雜，樣品保留時間長，所以需要一種簡單、快速、穩定、環保的測定方法，微乳色譜的出現正好可以解決這些問題。

微乳液相色譜(Microemulsion Liquid Chromatography，MELC)法，是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例混合，自發形成的各向同性、透明或半透明、低粘度、熱力學穩定的分散體系[22]。最常用的水包油型微乳是以十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)做表面活性劑，烷烴(庚烷、辛烷等)為油相，短鏈醇(丁醇、戊醇等)做助表面活性劑和一定量的水或緩沖液組成的體系。與常規高效液相不同，微乳中的表面活性劑與固定相表面吸附，使溶質在修飾后的固定相、微乳液滴、水相之間進行分配轉移達到平衡，改變組分在高效液相中兩相間的分配特性。因此，本研究建立同時測定化妝水中常用防腐劑的微乳色譜法，以期為化妝水中防腐劑的快速檢測提供技術支持。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

十二烷基硫酸鈉(SDS，w=99.5%，生物技術級)，上海麥克林生化科技有限公司；對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯(w>99.5%)，迪馬公司；甲基異噻唑啉酮、苯氧乙醇、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、山梨酸鉀(w>99.5%)，麥克林公司；氯苯甘醚(w>99.5%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正丁醇、正辛烷、磷酸均為分析純，廣州化學試劑廠；水為屈臣氏蒸餾水；檢測樣品為市售化妝品，樣品信息見表1。

表1 化妝水樣品信息

高效液相色譜儀1260系列，G1311A系列四元泵，G1314A系列DAD檢測器，Chem32工作站，安捷倫科技公司；KQ-250DE超聲波清洗器(頻率(35±5) kHz，功率250 W)，昆山市超聲儀器有限公司；Anke TDL80-2B離心機，上海安亭科學儀器廠；TX223L電子天平，SHIMADZU。

1.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，流量0.7 mL/min，進樣體積20 μL；流動相3.0%(W/V)十二烷基硫酸鈉SDS-6.0%(V/V)正丁醇-0.4%(V/V)正辛烷-90.6%(V/V)0.1%磷酸水。

1.3 標準儲備液的配制

分別精密稱取甲基異噻唑啉酮、苯氧乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、氯苯甘醚、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對羥基苯甲酸丁酯403 mg、245.5 mg、25.5 mg、129.5 mg、103.2 mg、4.5 mg、10.5 mg、499.92 mg、10.6 mg于10 mL、50 mL、25 mL、100 mL、25 mL、100 mL、50 mL、10 mL、50 mL容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，經0.22 μm濾膜過濾，得質量濃度分別為40.3 mg/mL、4.91 mg/mL、1.02 mg/mL、1.30 mg/mL、4.13 mg/mL、0.045 mg/mL、0.21 mg/mL、50.0 mg/mL、0.21 mg/mL的標準儲備液。

1.4 樣品預處理

取樣品1 g，精密稱定，置于25 mL具塞三角瓶，精密加入甲醇10 mL，稱重，振搖，超聲提取30 min，補足失重，經0.22 μm濾膜過濾，取續濾液為供試溶液。

2 結果與討論

2.1 專屬性

空白、混合標準溶液、樣品色譜圖如圖1～圖3所示，9種防腐劑保留時間分別為3.386 min，7.788 min，8.583 min，9.439 min，10.340 min，11.421 min，14.776 min，16.356 min，17.929 min。在選定色譜條件下，化妝水樣品G17中無雜質干擾測定。

圖1 空白樣品色譜圖

圖2 9種防腐劑混合標準溶液色譜圖

圖3 樣品(G17)色譜圖

2.2 提取溶劑

考察水、甲醇及兩種溶液混合后作提取溶劑，結果表明9種防腐劑在甲醇中提取效果最好，經甲醇提取后濾液澄清且穩定性高，目標防腐劑峰面積大且雜質峰少；用水或混合液提取后樣品不穩定且濾液渾濁。故以甲醇為提取溶劑。

2.3 提取方法

實驗考察超聲30 min、2500 r/min離心15 min、超聲30 min后以2500 r/min離心15 min三種提取方法，第二種方法提取后溶液渾濁，第一、三種方法提取后溶液澄清，但第三種方法提取后溶液底部有絮狀沉淀，最終采取超聲30 min作為樣品提取方法。

2.4 微乳色譜優化

2.4.1 表面活性劑

表面活性劑指加入少量能使其溶液體系界面狀態發生明顯變化的物質，通過降低溶液表面張力構成界面膜，形成穩定的微乳。目前微乳最常用的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)，一種無毒的陰離子表面活性劑，可作乳化劑，其生物降解度大于90%，降解速度快，是環保性能較好的表面活性劑。實驗用SDS作表面活性劑。

2.4.2 助表面活性劑

助表面活性劑主要影響體系的熱力學性質，起協助表面活性劑降低界面張力、增加界面流動性、增加微乳的膜強度及減少微乳形成時的界面彎曲，使微乳自發形成并穩定存在的作用。實驗考察異丙醇和正丁醇對分離的影響。以異丙醇為助表面活性劑時，色譜峰出現拖尾及分叉。支鏈的異丙醇對微乳形成無明顯的促進作用，可能因支鏈增加導致醇空間位阻增大，使其插入界面膜的阻力增大[23]。故以正丁醇為助表面活性劑。

2.4.3 油 相

在微乳色譜中，油相的加入增加了流動相中有機相比例，縮短保留時間；另一方面，油相分子分配到固定相上，使固定相的極性變小，使化合物的保留和選擇性變化更復雜[24]。實驗考察環己烷、正庚烷和正辛烷對分離選擇性的影響，以環己烷為油相時出現色譜峰分叉，環己烷增溶及洗脫能力均較弱，與溶劑的洗脫能力差異較大，易出現色譜峰分叉；以正庚烷為油相時，分離度好，但出現前沿峰，可能是流動相局部洗脫能力增強，樣品未被流動相充分稀釋，也有色譜峰分叉，且保留時間變長。故選擇正辛烷為油相。

2.4.4 流動相配制順序

實驗對比以表面活性劑-水相-助表面活性劑-油相以及表面活性劑-助表面活性劑-水相-油相為順序配制流動相，發現前者色譜峰保留時間變短，且流動相更穩定，在色譜柱中更易達到平衡，實驗中以此順序配制流動相。

2.4.5 流動相比例考察

實驗考察時通過調節SDS與水的比例，來確定SDS的范圍；采用稀釋法考察將SDS比例調低對分離的影響，即先按照3.0%SDS(W/V)-6.6%正丁醇(V/V)-0.8%正辛烷(V/V)-89.6%水(V/V)配制原溶液，量取一定量配制好的原溶液后，再加水使成400 mL。原溶液：水的比例為390:10、380:20、370:30比例下，苯氧乙醇峰形不佳，對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯色譜峰均拖尾，360:40比例下，以上四種防腐劑仍拖尾；350:50比例下，以上四種防腐劑基本分離，但其他組分不分離。實驗又考察固定正丁醇(6.6%，V/V)、正辛烷(0.8%，V/V)的比例，對比SDS(W/V)為3.0%、3.5%、4.0%時的色譜圖，發現比例為3.5%、4.0%時，保留時間較3.0%的均延后，4.0%的延后更明顯，且樣品均不能很好分離。最終確定流動相的比例為3.0%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)-6.0%(V/V)正丁醇-0.4%(V/V)正辛烷-90.6%(V/V)(0.1%磷酸)水。

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準曲線

分別吸取一定量的9種防腐劑對照品貯備液，加甲醇稀釋成不同濃度梯度的混合標準溶液，依次進樣，以相應的質量濃度為橫坐標，組分的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程和相關系數見表2，9種防腐劑在0.945～4999.2 μg/mL濃度范圍內呈現良好的線性關系且相關系數均大于或等于0.9996，可用于定量分析。

表2 9種防腐劑的線性范圍、回歸方程和相關系數

2.5.2 精密度實驗

取混合標準溶液的對照品溶液(甲基異噻唑啉酮、苯氧乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀、氯苯甘醚、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯和對羥基苯甲酸丁酯的質量濃度分別為2015 μg/mL、245.5 μg/mL、25.5 μg/mL、9.065 μg/mL、206.4 μg/mL、6.75 μg/mL、10.5 μg/mL、2499.6 μg/mL、10.6 μg/mL)進樣20 μL，連續測定6次，記錄峰面積，計算得RSD均小于1.88%，表明該方法精密度良好。

2.5.3 重復性實驗

取化妝水G17樣品 6份，每份1 g，按“2.5.2”項下方法處理，依次進樣20 μL，樣品所含防腐劑的峰面積RSD皆小于1.99%(n=6)，表明該分析方法重復性良好。

2.5.4 穩定性實驗

取化妝水樣品G17 1 g，按“2.5.2”項下方法處理，在0、2、4、6、8、10、12 h，分別進樣20 μL，記錄峰面積。結果樣品中所含防腐劑的RSD 皆小于0.97%，表明該化妝水樣品溶液在12 h內穩定。

2.5.5 加樣回收率

精密稱取化妝水樣品G17 0.5 g共9份，分別加入相應量的低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度的9種防腐劑對照品，每個質量濃度水平平行制備3份，按“2.5.2”項下方法處理，依次進樣20 μL，計算回收率，平均回收率為95.1%～104.6%，RSD為0.57%～5.30%，說明樣品回收率良好。

表3 樣品加樣回收結果

2.6 樣品測定

實驗前以調查問卷形式收集化妝水使用情況，測定使用人數較多的具一定代表性的29份市售化妝水樣品(其中6份為化妝水配套的乳液)。結果顯示，有9份化妝水同時含2種防腐劑，有7份化妝水同時含3種防腐劑；化妝水和其配套的乳液中添加的防腐劑并不完全一樣；部分化妝水成分表與本實驗實際檢出結果不一致。

根據實驗檢出結果，9種防腐劑在29份化妝水中的檢出率見圖4，其中標示率是按29份化妝水標簽成分表中含有的防腐劑計算所得。有13份化妝水樣品成分表中未標示含對羥基苯甲酸甲酯但卻檢出含有該防腐劑；已標示有對羥基苯甲酸乙酯的樣品全部檢出，但還有7份樣品未標示仍檢出該防腐劑；另外，9種防腐劑中，苯氧乙醇和對羥基苯甲酸甲酯都是檢出率較高的防腐劑成分，這兩種防腐劑也是化妝水中添加較為普遍的兩種成分，作為比較溫和的苯氧乙醇防腐體系，其檢出率和標示率相對比較接近，但是刺激度較高的對羥基苯甲酸甲酯，其檢出率卻是標示率的2倍，說明化妝水使用過程中造成過敏、炎癥等情況有可能是因為成分表中未準確標出全部的防腐劑造成，因此也提示消費者在購買化妝水時不能完全依賴成分表上的標示。

圖4 9種防腐劑檢出結果

3 結 論

近年來，化妝品中新型防腐劑發展迅速，使用頻率不斷增加[25]，本實驗中部分化妝水成分表標示的防腐劑與檢出結果不一致，對化妝水的監督檢驗與質量控制需引起重視，以保障人們使用的安全性。

本研究建立了同時測定化妝水中9種防腐劑的微乳色譜法并進行了系統研究，彌補了常規高效液相色譜法出峰時間較長的缺點[26-27]，分離效率高且速度快，前處理簡單，有機溶劑用量少，成本低，毒性低，環境污染小，更為綠色環保，可滿足市售化妝水中防腐劑的定性和定量分析要求。