干旱脅迫下玉米開(kāi)花期雄穗差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定與篩選

楊 杰，韓登旭，王業(yè)建，阿布來(lái)提·阿布拉，梁曉玲，郗浩江，李銘東，王 仙

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】玉米(ZeamaysL.)是中國(guó)乃至世界上栽培面積最大的糧食作物，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、工業(yè)原料、生物質(zhì)能源等領(lǐng)域，在保障我國(guó)糧食和能源安全方面具有重要作用(http://www.fao.org)。干旱脅迫是影響全球作物生產(chǎn)的重要非生物脅迫因子之一，研究植物耐旱機(jī)制已成為一個(gè)重要領(lǐng)域[1]。我國(guó)70%以上的玉米種植區(qū)經(jīng)常遭受干旱的影響，每年造成巨大的損失。玉米是典型的雌雄同株異花作物，雄穗是玉米主要的生殖器官。在雄穗花器官分化期，對(duì)干旱脅迫最為敏感，該階段遭遇干旱脅迫可引起胚子生長(zhǎng)發(fā)育不正常，導(dǎo)致花粉活力下降，結(jié)實(shí)不良，造成大幅度的減產(chǎn)[2]。【前人研究進(jìn)展】有研究認(rèn)為這種傷害的發(fā)生并不是由于生殖器官干旱脫水造成的，是由于營(yíng)養(yǎng)器官(如葉片)響應(yīng)干旱脅迫的間接作用引起的[3]。作物耐旱性屬于復(fù)雜的數(shù)量遺傳性狀，植物對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答是一個(gè)多基因控制的復(fù)合性狀，需要多個(gè)基因、蛋白和代謝途徑共同作用[4]。功能蛋白基因是指在植物逆境抗性中起作用的蛋白，在干旱脅迫下，能在細(xì)胞內(nèi)直接發(fā)揮保護(hù)功能。調(diào)節(jié)蛋白是指在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆激基因表達(dá)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。主要有磷脂酶、蛋白激酶以及轉(zhuǎn)錄因子等，通過(guò)這些調(diào)節(jié)蛋白來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)信息傳遞和基因表達(dá)能力，提高植物對(duì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力[5-6]。近年來(lái)，利用分子技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上有研究，并克隆了一些相關(guān)基因。但是在蛋白質(zhì)水平仍然有很多問(wèn)題尚未解決，干旱脅迫代謝網(wǎng)絡(luò)、大部分干旱誘導(dǎo)蛋白的功能和表達(dá)機(jī)理尚不清楚。雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)為研究干旱脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組變化、尋找耐旱相關(guān)基因提供了有利方法[7]。已應(yīng)用于多種作物的干旱脅迫研究。如使用2-DE和MS對(duì)棉花的耐旱性進(jìn)行研究，檢測(cè)出個(gè)550蛋白點(diǎn)，有16個(gè)蛋白上調(diào)，6個(gè)蛋白下調(diào)[8]。有研究通過(guò)研究水稻的差異蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了3種響應(yīng)干旱脅迫的蛋白質(zhì)，類胚胎晚期豐富蛋白、葉綠體銅鋅SOD蛋白和Rieske鐵硫蛋白，其中前2種蛋白上調(diào)，后2種蛋白下調(diào)。研宄表明，植物蛋白質(zhì)組在干旱脅迫下是高度動(dòng)態(tài)變化的，蛋白質(zhì)組學(xué)己成為研究不同植物耐旱機(jī)制的可行、有效手段[9]。差異蛋白質(zhì)組學(xué)在研究干旱脅迫下玉米的適應(yīng)性和發(fā)掘優(yōu)異耐旱基因上有著不可忽視的作用。對(duì)干早脅迫后4～14 d的2種玉米自交系進(jìn)行研宄，發(fā)現(xiàn)水分虧缺下葉片中有46種蛋白表達(dá)量明顯增加；部分蛋白表達(dá)量的提高具有基因型差異；同時(shí)，差異蛋白的變化不同：有些蛋白是恒定增加，有些則先快速增加再穩(wěn)定增加，而有些只是瞬時(shí)增加。這些研究大多是以干旱脅迫下的幼苗期玉米為研究對(duì)象，但是，在玉米生育期中，苗期對(duì)干旱脅迫的抵抗力相對(duì)較強(qiáng)，適度的干旱處理可促進(jìn)根系發(fā)育，增強(qiáng)植株的耐旱性[10]。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)于干旱脅迫下玉米開(kāi)花期雄穗差異蛋白質(zhì)組研究報(bào)道較少。分析玉米開(kāi)花期不同耐旱性玉米自交系的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，研究玉米響應(yīng)干旱脅迫的主要代謝途徑并發(fā)掘有價(jià)值的耐旱基因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以強(qiáng)耐旱系PHBA6和弱耐旱系吉63的雄穗小花為材料，采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定和篩選差異蛋白，分析不同耐旱性玉米自交系蛋白質(zhì)組響應(yīng)干旱的變化規(guī)律和內(nèi)在聯(lián)系，為研究玉米開(kāi)花耐旱提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2015～2016年在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠綜合試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。采用塑料條盆種植，盆長(zhǎng)60 cm，寬30 cm,高cm，花盆內(nèi)裝入草木灰、蛭石和試驗(yàn)田表層土(7∶3∶5)的混合物，每盆重10 kg。每盆種植5株玉米，盆高的3/4埋入土中，自然光照，正常灌水。強(qiáng)耐旱自交系PHBA6(PHZ51×PHG47)和弱耐旱自交系吉63[(127-32×鐵84)(W24×W20)輻)]，試驗(yàn)材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

樣品由南京起肽生物科技有限公司，進(jìn)行蛋白提取、凝膠電泳、質(zhì)譜分析和相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

1.2 方 法

1.2.1 干旱處理

在玉米雄穗抽出喇叭口之前，控制灌水，進(jìn)行干旱脅迫。夜間及陰雨天啟動(dòng)防雨棚，晴天白天收起防雨棚，以使玉米植株在自然條件下正常生長(zhǎng)。共分干旱脅迫10 d和干旱脅迫0 d(正常灌水～CK)2個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。分別取各處理植株的雄穗花藥，用液氮速凍，于-70℃凍存待用。

1.2.2 總蛋白提取與樣品制備(TCA/丙酮法)

將樣品放于研缽中，加入液氮研磨粉碎(研磨過(guò)程中加入適量 PVP)。將磨好的樣品粉末放入 50 mL離心管中，加入-20℃預(yù)冷的 10% TCA-丙酮溶液(含 0.1% DTT 和 1 mM PMSF)，-20℃靜置過(guò)夜。15 000 r/min，4℃，離心 20 min，棄上清。在沉淀物中加入-20℃冰箱預(yù)冷的丙酮溶液(含 0.1% DTT 和 1 mMPMSF)，-20℃靜置 2 h。15 000 r/min，4℃，離心 20 min，棄上清。將沉淀物放入冷凍真空干燥機(jī)中干燥 30 min。將干燥的蛋白粉末至于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.3 蛋白酶解與雙向電泳

從膠上切取待鑒定蛋白，分別放入離心管中，寫上標(biāo)記。每管用超純水清洗膠點(diǎn)3次，棄去水分。每管用50 μL碳酸氫銨(100 mmol/L NH4HCO3)進(jìn)行脫色。每管用50 μL去離子水處理5 min，棄去多余水分。每管加入50 μL含50% ACN的水溶液處理5 min，棄去多余溶液，加入100% ACN處理5 min。每管加入5μL含10 ng Trypsin酶的碳酸氫銨溶液(50 mmoL/L NH4HCO3)。每管用20 μL碳酸氫銨溶液進(jìn)行覆蓋，37℃酶解16 h。加5 μL5% TFA終止10 min。

蛋白上樣量：1 500 μg；膠條24 cm pH 4-7 IPG 預(yù)制干膠條,取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液，室溫溶解；加入0.01 g DTT，Bio-Lyte 4-7 的電解質(zhì) 10 L，混勻；取400 L水化上樣緩沖液，加入100 L樣品，混勻；取出 IPG 預(yù)制膠條，將樣品與上樣緩沖液混合溶液加到聚焦槽中；分清膠條的正負(fù)極，將膠條放到聚焦槽中；在每根膠條上覆蓋 3 mL 礦物油。蓋上蓋子，設(shè)置等電聚焦程序。

1.2.4 質(zhì)譜分析與搜庫(kù)鑒定

吸取酶解后的溶液上清1μL點(diǎn)在樣品靶上，待干燥后，同樣點(diǎn)1μL的HCCA基質(zhì)溶液，全部干燥后上機(jī)分析。樣品靶放入MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀，啟動(dòng)控制軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

質(zhì)譜采集參數(shù)：正離子反射模式，一級(jí)質(zhì)譜分子量范圍為700～3 500 Da，二級(jí)質(zhì)譜分子量范圍為40～1 050 Da。合并一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，產(chǎn)生peak list文件；利用MASCOT搜索引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.5 電泳凝膠圖像

經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的雙向電泳凝膠在UMAX PowerLook 2100XL掃描儀(MaxiumTechnologies, Taipei, China), 300 dpi的分辨率和16位的灰階，進(jìn)行圖像掃描。

1.2.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)檢索

酶解后的肽段用MALDI-TOF-TOF進(jìn)行質(zhì)譜分析。得到的MS/MS數(shù)據(jù)在MASCOT網(wǎng)站(www.matrixscience.com)(Matrix Science Ltd., London, U.K.)進(jìn)行搜索，肽質(zhì)量指紋圖譜容許誤差為0.3。

1.2.7 蛋白功能分類

使用http://61.50.138.118/gofact上的預(yù)測(cè)軟件GOfac對(duì)上述鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能鑒定。

1.2.8 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

開(kāi)花期調(diào)查水旱區(qū)強(qiáng)耐旱系PHBA6和弱耐旱系吉63植株葉片卷曲度、抽雄期、散粉期、吐絲期等性狀。采用SPAD-502Plus便攜式葉綠素儀在干旱脅迫期檢測(cè)葉片葉綠素含量；采用NZ99-TWS-1土壤溫度，水分溫濕度計(jì)對(duì)土壤含水量及溫濕度進(jìn)行檢測(cè)；采用RC-4HC Elitecg儀器對(duì)試驗(yàn)小區(qū)大氣溫濕度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel2003進(jìn)行處理，所測(cè)定的各生理指標(biāo)用SPSS 13.0 package for Windows(SPSS Inc.Chicage, IL, USA)中的one-way ANOVA進(jìn)行方差分析。使用PDQuest軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，利用 MASCOT 搜索引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定與篩選

2.1.1 雙向凝膠電泳

對(duì)強(qiáng)耐旱自交系PHBA6和弱耐旱自交系吉63進(jìn)行干旱脅迫與正常灌溉處理，開(kāi)花期取其雄穗小花樣品，經(jīng)雙向凝膠電泳分離和凝膠圖像掃描、分析。以每片膠上樣量1 500 μg、上樣體積450 μl(不足體積用裂解液補(bǔ)足)的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)pH4～7、24 cm非線性IPG預(yù)制膠等電聚焦，12.5%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)作第二向電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，獲得圖譜，經(jīng)PDQuest 8.0 軟件分析得出：考馬斯亮藍(lán)染色圖譜中共有542個(gè)高清晰、重復(fù)性強(qiáng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。圖1

注：第一向是PH4-7IPG膠條中進(jìn)行；第二向在12%de SDS-PAGE膠完成A:吉63干旱脅迫7 d(大圖標(biāo)記)); B:吉63正常灌溉(CK)；C:吉63干旱脅迫7 d；C:PHBA6正常灌溉(CK)；D: 干旱脅迫7 d

Note:The first is always carried out in PH4-7IPG rubber strip; The second direction is completed at 12% DE sds-page glue.A: J63 drought stress 7 d(large map marker));B: J63 normal irrigation(CK);C: J63 drought stress 7 d;C:PHBA6 normal irrigation(CK);D: drought stress 7 d

圖1 PHBA6與吉63雄穗蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram analysis of PHBA6 and J63 male spike protein

2.1.2 質(zhì)譜鑒定

對(duì)雙向凝膠電泳后考馬斯亮藍(lán)染色圖譜中542個(gè)高清晰、重復(fù)性強(qiáng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，篩選出的59個(gè)差異表達(dá)豐度達(dá)2.0倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)這59個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)再進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析(質(zhì)譜采集參數(shù)：正離子反射模式，一級(jí)質(zhì)譜分子量范圍為700～3 500 Da，二級(jí)質(zhì)譜分子量范圍為40～1 050 Da。)、Mascot軟件在線搜索。其中，共有57個(gè)差異蛋白鑒定成功，2個(gè)差異蛋白鑒定失敗。對(duì)鑒定成功的57個(gè)差異蛋白進(jìn)一步進(jìn)行信息檢索與主要功能分析。

質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，干旱脅迫10 d和0 d(正常灌溉CK)影響PHBA6和吉63花器官分化期雄穗的蛋白質(zhì)組成變化差異較大。一些功能蛋白質(zhì)的表達(dá)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)或者抑制下調(diào)。鑒定出差異表達(dá)豐度達(dá)2.0倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有59個(gè)，強(qiáng)耐旱系PHBA6中有26個(gè)，弱耐旱系吉63中有37個(gè)，在強(qiáng)耐旱系PHBA6與弱耐系吉63中都表達(dá)且差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)有4個(gè)。這些蛋白質(zhì)分別參與糖代謝、能量代謝、解毒作用、細(xì)胞架的構(gòu)建和細(xì)胞程序性死亡等生命活動(dòng)過(guò)程。表1～2

表1 Mascot軟件在線搜索參數(shù)

Table 1 Online search parameters of Mascot software

選項(xiàng)SettingParameter設(shè)定參數(shù)SettingParameterEnzymeTrypsin最大允許錯(cuò)切位點(diǎn)1FixedmodificationsCarbamidomethylationVariablemodificationsOxidized一級(jí)質(zhì)譜容差150ppm二級(jí)質(zhì)譜容差0.6DaP值≤0.05

表2 差異相應(yīng)蛋白質(zhì)點(diǎn)信息

Table 2 Statistical table of corresponding protein point information

序號(hào)No.樣品編號(hào)SampleID質(zhì)譜編號(hào)MSIDNCBI編號(hào)NCBIID蛋白名稱,物種NameofProtein,Species得分Score分子量MolecularWeight等電點(diǎn)IEP肽段數(shù)NumberofPeptides覆蓋率CoverageRate(%)PHBA6變化PHBA6Vary吉63變化吉63Vary1104B06DAA42660.1TPA:hypotheticalproteinZEAMMB73_513866[Zeamays]6660919.141181.200.462207鑒定失敗///////1.652.133208A07ACG28457.1chlorophylla-bbindingprotein8[Zeamays]40289668.94140.722.064209A13BAA05550.1group3LeaproteinMGL3[Zeamays]50227458.80151.962.135405C02ACG47181.14-nitrophenylphosphatase[Zeamays]101395015.46241.360.4861208C01ACG24464.1pyridoxinbiosynthesisproteinER1[Zeamays]168338326.123110.491.0071210B04ACG32444.1ran-bindingprotein1[Zeamays]42239324.82144.060.7981212C06AFW62651.12-hydroxy-3-oxopropionatereductase[Zeamays]72307807.632191.042.9891213A18ACG32444.1ran-bindingprotein1[Zeamays]44239324.821418.140.90101413B20ACG44614.1peptidyl-prolylcis-transisomerase[Zeamays]67468394.91130.431.88111414B23ACG33017.1fructose-bisphosphatealdolase[Zeamays]281405065.39370.501.03121705B08CBC02984.1unnamedproteinproduct[Zeamays]233711805.08472.430.90131904B11AFW68729.1hypotheticalproteinZEAMMB73_143161[Zeamays]361339774.89110.980.46142212C08ACN27757.1unknown[Zeamays]69268618.65242.161.10152214B10ACF83476.1unknown[Zeamays]73174445.15162.391.15162504B01DAA46730.1TPA:putativeleucine-richrepeatreceptor-likeproteinkinasefamilyprotein[Zeamays]431098787.51112.050.88172604B16DAA60026.1TPA:hypotheticalproteinZEAMMB73_761585[Zeamays]57422848.14121.612.17182605A24ACG35066.1pyruvatedehydrogenaseE1componentalphasubunit[Zeamays]41431058.06131.122.21192708A09CBC02794.1unnamedproteinproduct[Zeamays]107714435.10240.762.90203116A17AAM15999.1glycine-richRNAbindingprotein,partial[Zeamays]41159555.22161.120.35213202鑒定失敗///////3.481.05223203B21ACN36053.1unknown[Zeamays]未知結(jié)構(gòu)蛋白130374555.59292.093.88233204B19ACN27757.1unknown[Zeamays]64268618.65240.890.49243205A04CBD21727.1unnamedproteinproduct[Zeamays]45472245.29130.552.04

續(xù)表2 差異相應(yīng)蛋白質(zhì)點(diǎn)信息

Table 2 Statistical table of corresponding protein point information

序號(hào)No.樣品編號(hào)SampleID質(zhì)譜編號(hào)MSIDNCBI編號(hào)NCBIID蛋白名稱,物種NameofProtein,Species得分Score分子量MolecularWeight等電點(diǎn)IEP肽段數(shù)NumberofPeptides覆蓋率CoverageRate(%)PHBA6變化PHBA6Vary吉63變化吉63Vary253305A01ACN29302.1unknown[Zeamays]161352865.572102.651.00263405B02ACN33222.1unknown[Zeamays]61506345.38150.982.27273406B12ACN29323.1unknown[Zeamays]50531095.69120.491.77283603A20ACG47397.1NADP-dependentmalicenzyme[Zeamays]109658545.65362.560.86294207B22BAA00009.1triosephosphateisomerase[Zeamays]112272365.52281.080.43304510C10AGV02653.1ATPsynthaseCF1alphasubunit(chloroplast)[Zeamayssubsp.mays]137557135.87370.421.07315208A22ACG41059.1isoflavonereductaseIRL[Zeamays]90328735.52132.030.83325210B07ACO06084.1ascorbateperoxidase[Zeamays]64274685.64150.972.01335213A21ACG37051.1PURALPHA-1[Zeamays]95333855.72260.950.50345410A06ACG32614.1S-adenosylmethioninesynthetase1[Zeamays]腺苷硫氨酸合成酶61429865.50130.492.03355709C111ITZ_AChainA,MaizeTransketolaseInComplexWithTpp[Zeamays]82733475.47211.992.08366114A16AAM15999.1glycine-richRNAbindingprotein,partial[Zeamays]79159555.22161.002.08376115B03ACG35067.1auxin-inducedproteinPCNT115[Zeamays]生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白217380496.383123.052.06386207A05ACG28457.1chlorophylla-bbindingprotein8[Zeamays]87289668.94141.230.33396208A11CBD21262.1unnamedproteinproduct[Zeamays]未知蛋白98192908.991102.610.39406407C05ACN31759.1unknown[Zeamays]183455075.99250.892.69416506B17DAA52456.1TPA:hypotheticalproteinZEAMMB73_865472[Zeamays]40534145.84110.500.88426606A10CBC13192.1unnamedproteinproduct[Zeamayss]168562446.07240.481.85436802A02ACN33229.1unknown[Zeamays]44914075.21110.922.04446805A03CBC10208.1unnamedproteinproduct[Zeamays]56906395.12350.491.17457204C04DAA53902.1TPA:hypotheticalproteinZEAMMB73_994622[Zeamays]51215459.06180.640.49467405C09ACG25573.1D-3-phosphoglyceratedehydrogenase[Zeamays]86641126.80230.870.50477406C07ACG38977.1glutamate-1-semialdehyde2,1-aminomutase[Zeamays]111502236.13120.221.00

續(xù)表2 差異相應(yīng)蛋白質(zhì)點(diǎn)信息

Table 2 Statistical table of corresponding protein point information

序號(hào)No.樣品編號(hào)SampleID質(zhì)譜編號(hào)MSIDNCBI編號(hào)NCBIID蛋白名稱,物種NameofProtein,Species得分Score分子量MolecularWeight等電點(diǎn)IEP肽段數(shù)NumberofPeptides覆蓋率CoverageRate(%)PHBA6變化PHBA6Vary吉63變化吉63Vary487512B24AGV02653.1ATPsynthaseCF1alphasubunit(chloroplast)[Zeamayssubsp.mays]42557135.87251.070.49497603A15AAD10504.1NADP-malicenzyme[Zeamays]61735526.60111.062.90507711B09AAK91502.1NADP-dependentmalicenzyme[Zeamays]104712116.46341.112.03518204A12AAB04687.1histoneH2A[Zeamays]461641710.59150.852.06528310C03ACN32075.1unknown[Zeamays]244384086.374101.142.49538405B13ACN31389.1unknown[Zeamays]108501756.55122.181.21548407A14P24825.1RecName:Full=ChalconesynthaseC2;AltName:Full=Naringenin-chalconesynthaseC267435676.33240.662.05558408A19P24825.1RecName:Full=ChalconesynthaseC2;AltName:Full=Naringenin-chalconesynthaseC296435676.33241.192.17568409B15ACG32271.1GDP-mannose3,5-epimerase1[Zeamays]296433285.944131.103.76379301B18P08440.1RecName:Full=Fructose-bisphosphatealdolase,cytoplasmicisozyme65390367.52142.071.06589303B05ACG32359.1auxin-inducedproteinPCNT115[Zeamays]108378447.62240.471.60599502A08DAA45489.1TPA:hypotheticalproteinZEAMMB73_259316[Zeamays]40469179.79140.652.38

2.2 差異表達(dá)蛋白功能分類

2.2.1 GO功能分類

研究表明，強(qiáng)耐旱系PHBA6中差異蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括代謝物和能量前體合成、核苷酸代謝、丙酮酸代謝過(guò)程、含吡啶化合物的復(fù)合代謝過(guò)程、氧化還原輔酶代謝過(guò)程和蛋白的膜定位等；弱耐旱系吉63中差異蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程主要有蛋白翻譯調(diào)控、細(xì)胞蛋白質(zhì)及氨基酸代謝過(guò)程的調(diào)控、含硫化合物的合成與代謝過(guò)程、半胱氨酸的生物合成及代謝過(guò)程和光合作用等。細(xì)胞組分分類顯示二者中的差異蛋白都與葉綠體及其結(jié)構(gòu)相關(guān)。強(qiáng)耐旱系PHBA6中差異蛋白參與的分子功能分類主要包括二磷酸果糖醛酶、乙醛裂解酶、二氨基庚酸轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶及碳酸脫水酶等一些酶的活性；而弱耐旱系吉63中差異蛋白參與的分子功能主要是3-羥基丁酸脫氫酶的活性、poly RNA 的結(jié)合、轉(zhuǎn)羥乙醇酶活性和GDP的解離抑制劑活性等。在弱耐系吉63中細(xì)胞代謝過(guò)程是被促進(jìn)的，在吉63中基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞大分子生物合成調(diào)控，被抑制的。二者差異蛋白的細(xì)胞組分分類一致，而在生物學(xué)過(guò)程及分子功能分類上相差較大。圖2

注：a圖為PHBA6品種干旱處理前后差異蛋白的GO功能分析結(jié)果；b圖為吉63品種干旱處理前后差異蛋白的GO功能分析結(jié)果

Note:a shows the GO function analysis results of different proteins of PHBA6 varieties before and after drought treatment.b shows the GO function analysis results of different proteins before and after drought treatment

圖2 差異蛋白GO功能

Fig.2 FunctionaLAnalysis of differentiaLProtein GO

2.2.2 KEGG通路

研究表明，PHBA6和吉63 2個(gè)自交系的差異蛋白通路基本一致，大部分蛋白由于功能未知，導(dǎo)致信號(hào)通路不明確。在強(qiáng)耐旱系PHBA6中的差異蛋白中功能未知蛋白占75%，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的加工的蛋白占8%，參與氮代謝和硫胺素代謝的蛋白占4%。在弱耐旱系吉63中的差異蛋白中功能未知蛋白占82%，參與氮代謝、硫胺素代謝、黃酮類化合物合成和光合天線蛋白均占3%。

在KEGG通路分析中，弱耐旱系吉63中的差異蛋白主要參與到下圖所示的通路中，最為顯著的是Thiamine metabolism(硫胺代謝蛋白)、Photosynesis-antenna proteins(光合作用-天線蛋白質(zhì))和Flavonoid biosynthesis(類黃酮生物合成蛋白)，這3個(gè)代謝過(guò)程對(duì)植物抵御非生物逆境有重要的作用。圖3

注：a圖為PHBA6品種干旱處理前后差異蛋白的KEGG通路分析結(jié)果；b圖為吉63品種干旱處理前后差異蛋白的KEGG通路分析結(jié)果。

Note:a shows the KEGG pathway analysis results of different proteins in PHBA6 varieties before and after drought treatment.bshows the KEGG pathway analysis results of different proteins before and after drought treatment.

圖3 差異蛋白KEGG通路

Fig.3 Analysis of differentiaLProtein KEGG pathway.

2.2.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

研究表明，PHBA6品種中差異蛋白形成了10個(gè)功能組，主要涉及氨基糖和核苷酸糖代謝(3個(gè)蛋白)、淀粉和蔗糖的代謝(3個(gè)蛋白)、氮素代謝(2個(gè)蛋白)、剪接體(6個(gè)蛋白)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(6個(gè)蛋白)、硫胺素代謝(2個(gè)蛋白)、果糖和甘露糖代謝(6個(gè)蛋白)、葡聚糖(6個(gè)蛋白)、磷酸戊糖途徑(6個(gè)蛋白)和光合器官的碳固定(6個(gè)蛋白)等。吉63品種中差異蛋白也形成了10個(gè)功能組，主要涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(4個(gè)蛋白)、內(nèi)吞作用(4個(gè)蛋白)、剪接體(4個(gè)蛋白)、硫胺素代謝(2個(gè)蛋白)、類黃酮合成(3個(gè)蛋白)、生物鐘(3個(gè)蛋白)、氮素代謝(2個(gè)蛋白)、谷胱甘肽代謝(3個(gè)蛋白)、抗壞血酸和醛糖代謝(3個(gè)蛋白)和光合天線蛋白(4個(gè)蛋白)等。圖4

注：a圖為PHBA6品種差異的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；b圖為吉63品種差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

Note:a shows the protein interaction network of PHBA6 varieties.b shows the interaction network of different proteins of J63

圖4 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

Fig.4 DifferentiaLProtein interaction network

3 討 論

研究結(jié)果表明，干旱脅迫10 d和0(正常灌溉CK)影響PHBA6和吉63花器官分化期雄穗的蛋白質(zhì)組成變化差異較大。一些功能蛋白質(zhì)的表達(dá)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)或者抑制下調(diào)。鑒定出差異表達(dá)豐度達(dá)2.0倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有59個(gè)，強(qiáng)耐旱系PHBA6中有26個(gè)，弱耐旱系吉63中有37個(gè)，在強(qiáng)耐旱系PHBA6與弱耐系吉63中都表達(dá)且差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)有4個(gè)。

GO功能分類分析，強(qiáng)耐旱系PHBA6中差異蛋白參與的分子功能分類主要包括二磷酸果糖醛酶、葡萄糖磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶及碳酸脫水酶等一些酶的活性。KEGG通路分析，弱耐旱系吉63中的差異蛋白主要參與到下所示的通路中，最為顯著的是Thiamine metabolism(硫胺代謝蛋白)、Photosynesis-antenna proteins(光合作用-天線蛋白質(zhì))和Flavonoid biosynthesis(類黃酮生物合成蛋白)，這3個(gè)代謝過(guò)程對(duì)植物抵御非生物逆境有重要的作用。

果糖-l,6-二磷酸醛縮酶是生物體內(nèi)碳代謝及糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一,也是卡爾文循環(huán)的重要限速酶之一,它催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮的醇醛縮合反應(yīng)可逆的生成果糖-1,6-二磷酸。該酶既參與了糖酵解和糖異生過(guò)程，又參與了磷酸戊糖途徑和卡爾文循環(huán),直接影響植物體內(nèi)蔗糖和淀粉的積累,為生物體物質(zhì)合成代謝提供能量ATP和底物，果糖-1,6-二磷酸醛縮酶對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)起到至關(guān)重要的作用[12]。硫胺代謝蛋白、光合作用-天線蛋白質(zhì)和類黃酮生物合成蛋白等能夠有效地減弱干旱脅迫下植物蛋白氧化損傷程度，從而增強(qiáng)玉米抵御干旱的能力，以上研究結(jié)果與劉振斌等研究結(jié)果一致[12-15]。

4 結(jié) 論

以強(qiáng)耐旱系PHBA6和旱敏感系吉63開(kāi)花期干旱脅迫處理下的小花蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，采用質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)分析，在強(qiáng)耐旱系PHBA6中二磷酸果糖醛酶、葡萄糖磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶及碳酸脫水酶等一些酶的活性增強(qiáng)，所控制的蛋白上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)了玉米抵御干旱的能力；而在旱敏感系吉63中，硫胺代謝蛋白、光合作用-天線蛋白質(zhì)和類黃酮生物合成蛋白等能夠有效地減弱干旱脅迫下植物蛋白氧化損傷程度，增強(qiáng)玉米抵御干旱的能力。