MicroRNA-1301在肝癌中的表達及臨床意義

（南京醫科大學附屬無錫第二醫院 肝膽外科，江蘇 無錫 214001）

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界第5大常見的惡性腫瘤，中國患者約占55%[1]。手術是治療HCC的主要方式，但術后復發率高，其5年生存率仍較低[2]。microRNA（miRNA）是一群內源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'非編碼區（3'UTR）結合，導致靶基因mRNA 降解或翻譯受阻，以參與靶基因的轉錄后調節[3]。有研究表明，miR-1301在包括HCC 內的多種腫瘤中表達下調，對腫瘤的發生、發展起到抑制作 用[4-7]，但其與肝癌患者臨床預后關系尚不明確。本研究通過檢測HCC組織中miR-1301的表達水平，分析其與患者臨床數據及預后的關系，可能為HCC 患者預后評估提供新的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2014年1月在南京醫科大學附屬無錫第二醫院行HCC根治手術的60例患者臨床資料、組織樣本及隨訪資料。根據miR-1301相對表達量數值的中位數截點，將患者分為高表達組和低表達組，每組30例。所有癌組織及相應癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm的正常肝臟組織）均與液氮速凍并保存于-80℃冰箱。患者術后第1、3及6個月復查CT、血清甲胎蛋白（alpha-fetal protein,AFP），之后每半年復查CT及AFP，所有考慮復發轉移的患者有CT、超聲造影、AFP或穿刺活檢病理等其中2或3項診斷，患者隨訪時間截至2019年1月。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

所有肝癌組織及癌旁組織的RNA 通過Trizol（美國Invitrogen公司）提取，具體步驟參照試劑盒說明書。通過逆轉錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）將RNA 逆轉錄成互補DNA，然后應用miR 特異性TaqMan 探針和TaqMan Universal PCR Master Mix（美國ABI公司）進行miR-1301的實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測，反應在StepOne Plus 探測系統（美國ABI公司）上進行，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，60℃延伸1 min，共40個循環。內參為RNU6B，每個反應設置3個復孔，miR-1301的相對表達量用2-??Ct法計算。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，影響因素的分析用多因素Cox 風險比例模型，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-1301在肝癌組織中表達降低

癌組織組與癌旁組織組miR-1301相對表達量分別為（26.900±8.994）和（41.183±10.759），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.824，P=0.000），癌組織組低于癌旁組織組。見圖1。

圖1 HCC 患者癌組織與癌旁組織中miR-1301相對表達量比較（±s）

2.2 miR-1301相對表達量與患者臨床病理特征的關系

miR-1301相對表達量在患者性別、年齡、乙型肝炎病毒、腫瘤部位、AFP水平及Child分級比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；而腫瘤直徑、臨床分期及有無脈管癌栓比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同影響因素的miR-1301的高表達率比較

續表1

2.3 miR-1301表達下調提示肝癌患者不良預后

為分析miR-1301表達與患者臨床預后的關系，繪制miR-1301 低表達組和高表達組Kaplan-Meier曲線。miR-1301 低表達組總生存為23.33%（7/30），miR-1301 高表達組總生存為50.00%（15/30），經Log-rank χ2檢驗，結果顯示miR-1301 低表達組肝癌患者總生存率低于高表達組（χ2=0.032，P=0.021）（見 圖2）。單因素分析顯示，腫瘤直徑、脈管癌栓、臨床分期及miR-1301表達量與患者不良預后有關（P＜0.05）。多因素Cox 回歸模型分析顯示，腫瘤直徑、脈管癌栓臨床分期、miR-1301 低表達是影響肝癌預后的獨立因素（P＜0.05）。見表2。

圖2 HCC組織中miR-1301表達與患者總生存率的關系

表2 肝癌患者術后預后影響因素的單因素及多因素分析參數

3 討論

miRNA是一類長約23 個核苷酸序列的非編碼小RNA，對幾乎所有腫瘤的發生、發展過程扮演重要角色，例如HCC，其參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及轉移等生物過程[8]。近年來在腫瘤預后標志物研究領域，miRNA 已成為新的研究熱點，已發現多個miRNA與肝癌的臨床預后相關，其具有成為肝癌預后分子標志物的潛能[9-12]。

越來越多的研究表明，miR-1301 對包括HCC 內的多種腫瘤表達下調，對腫瘤的發生、發展起到抑制作用，提示患者的不良預后。YANG 等[4]發現，miR-1301 在肝癌中表達下調，靶向調控BCL9 mRNA，通過Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌的侵襲、轉移及血管形成。ZHI 等[6]發現，miR-1301 通過靶向調控N-Ras 抑制人膠質瘤細胞的增殖，此外miR-1301 的表達下調還與膠質瘤患者不良預后相關[12]。YAO 等[14]研究發現，miR-1301 可通過介導RanGAP1 下調，增加慢性粒細胞白血病患者伊馬替尼的療效。本研究同樣發現，miR-1301 在肝癌組織中表達下調，首次發現miR-1301 表達水平與肝癌患者的腫瘤直徑、臨床分期及有無脈管癌栓相關，Kaplan-Meier 生存分析結果提示，miR-1301 高表達組總生存率高于低表達組，進一步單因素及多因素分析提示，miR-1301 表達量是影響肝癌預后的獨立因素，可能為肝癌的預后評估提供新的途徑。

綜上所述，miR-1301 在多種腫瘤中扮演抑癌基因作用，miR-1301 的表達下調促進腫瘤的發生、發展，提示患者的不良預后。一種miRNA 可調控不同的靶基因從而發揮不同的生理功能。進一步研究miR-1301 在肝癌發生、發展中的具體分子機制，可能為肝癌的診斷、治療及預后評估提供新的分子標志物。