調節性B細胞在吉蘭-巴雷綜合征患者外周血中的表達及意義*

郝晨光，王艷，馬建華

[1.新疆醫科大學第一附屬醫院昌吉分院（昌吉市第二人民醫院）神經內科，新疆 昌吉 831100；2.新疆醫科大學第一附屬醫院 神經內科，新疆 烏魯木齊 830054]

吉蘭- 巴雷綜合征（Guillain-Barre syndrome,GBS）是一種自身免疫介導的周圍神經疾病，是引起四肢急性對稱遲緩性癱瘓的最常見致病因素之一。一旦發病可嚴重影響患者的生活質量，甚至出現呼吸肌麻痹，危及患者生命，給社會及家庭造成沉重的負 擔[1]。但GBS 具體的發病機制及發病環節中具體的免疫作用機制仍不明確。調節性B細胞（regulatory B cells,Bregs）是新發現的B細胞亞群。有研究證實Bregs在免疫相關性疾病中具有負向免疫調節的作用，在神經免疫性疾病，如臨床孤立綜合征、多發性硬化等患者外周血中均存在Bregs 數量或功能的異常[2-4]。國內外鮮有針對GBS患者外周血中Bregs及相關細胞因子表達的研究報道，筆者旨在通過分析GBS患者外周血中Bregs 亞群的數量，探討其在疾病發生過程中的臨床意義及免疫學機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月—2019年6月新疆醫科大學第一附屬醫院昌吉分院收治的GBS患者50例作為GBS組。其中，男性33例，女性17例；年齡6 ～83歲，平均（45.12±20.54）歲；病程1 ～15 d，平均病程（7.9± 3.4）d。納入標準：符合2010年《中國GBS 診治指南》診斷標準[5]。排除標準：排除其他自身免疫性疾病、白血病、淋巴瘤、器官移植、甲狀腺功能亢進癥、橋本甲狀腺炎、甲狀腺功能減退癥、乙型病毒性肝炎、人類免疫缺陷病毒感染等。選取同期本院健康體檢者50例作為對照組。其中，男性30例，女性20例；年齡8 ～72歲，平均（46.78±16.87）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑及儀器

PBS 無菌液體、紅細胞裂解液、FITC-單克隆鼠抗人CD19 抗體、PE-單克隆鼠抗人CD24 抗體、APC-單克隆鼠抗人CD38 抗體及APC-單克隆鼠抗人CD27 抗體均購自美國Becton Dickinson公司，流式細胞儀（Apriall型）購自美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

將乙二胺四乙酸抗凝血70μl 置于2個試管，標記為Br1、Br2。Br1 中加入FITC-單克隆鼠抗人CD19 抗體、PE-單克隆鼠抗人CD24 抗體及APC-單克隆鼠抗人CD38 抗體。Br2 中加入FITC-單克隆鼠抗人CD19 抗體、PE-單克隆鼠抗人CD24 抗體及APC-單克隆鼠抗人CD27 抗體。Br1、Br2 混勻室溫避光孵育18 min，加紅細胞裂解液2 ml，室溫避光5 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml PBS 洗滌，再次2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入PBS 3 ml 重懸。室溫避光孵育后用流式細胞儀檢測CD19+CD24hiCD38hiBreg、CD19+CD24hiCD27+Breg細胞。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞表型比例比較

GBS組CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞表型比例為（3.98±1.18）%，對照組為（6.88±2.20）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-6.932，P=0.005），GBS組較對照組低。見圖1。

圖1 外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞表型流式細胞圖

2.2 兩組外周血CD19+CD24hiCD27+Breg細胞表型比例比較

GBS組CD19+CD24hiCD27+Breg細胞表型比例為（13.67±3.79）%，對照組為（23.97±4.84）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-11.853，P=0.007），GBS組較對照組低。見圖2。

圖2 外周血CD19+CD24hiCD27+Breg細胞表型流式細胞圖

3 討論

GBS是一種自身免疫性、感染后免疫介導疾病，其特點是自身抗體的產生、補體的激活，以及對神經節苷脂的T 反應活性。有研究發現，包括T1細胞、T2細胞和Treg細胞在內的幾個免疫細胞亞群參與了GBS 自身抗體的產生[6]。通過產生IL-23/IL-17，濾泡T 輔助細胞的頻率也與GBS 有關，然而Bregs細胞是否參與這一過程尚不清楚。

B細胞是體液免疫的核心成分之一。傳統觀念認為B細胞的主要作用在于產生抗體，直到后來發現其直接參與細胞免疫。B 淋巴細胞通過抗原呈遞、共刺激和細胞因子產生參與T細胞活化；其影響機體組織中的抗菌保護機制和炎癥過程，充當控制細胞和體液免疫反應的調節細胞。早在20 世紀70年代，人們就首次提出存在能夠抑制免疫反應的B細胞。僅20年后，通過實驗性自身免疫性腦炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）這一多發性硬化的動物模型，首次可靠地描述了B細胞的調節特性[7]。在EAE小鼠模型的實驗中發現，與有自愈傾向的野生型小鼠相比，EAE 可使B細胞缺陷的C57BL/6小鼠疾病進一步進展，表明小鼠體內可能存在抑制炎癥反應的B細胞亞群，找到了Bregs 存在的有力證據[7]。2002年MIZOGUCHI 等[8]在炎癥性腸病動物模型中找到了Bregs 存在的有力證據，并將這種發揮疾病抑制作用的B細胞亞群命名為Bregs。

Bregs是一小部分B細胞群，參與免疫調節和抑制免疫反應[9]。到目前為止，Bregs 究竟是起源于一個特定的祖細胞，還是起源于傳統的B細胞亞群，還不清楚，因此很難確定Bregs的確切表型[10]。然而，有一種共識認為Bregs 主要通過分泌細胞因子發揮免疫調節作用[11]。在人類中，CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD24hiCD27+B細胞都通過分泌IL-10 來控制免疫反應[12-13]。然而，這2個亞群對T細胞有不同的影響。含有未成熟B細胞標志物CD38的Bregs 被認為能夠誘導T 調控細胞的發育，同時限制T1和T17細胞的分化。而具有記憶B細胞標志CD27的Bregs主要負責抑制CD4+T細胞的活性。此前有研究認為CD19+IL-10 Bregs與人類CD24hiCD27+B細胞相對應[14]。因此，筆者重點研究CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs在GBS患者中的表達頻率和免疫調節功能。

自身免疫性疾病的發生是機體免疫系統不能正確識別自體抗原和異體抗原，發生交叉免疫反應，出現免疫調節紊亂，導致自身免疫性疾病的發生。近年研究發現Bregs在維持機體內環境免疫穩態及調節免疫耐受中起到極其重要的作用，并與自身免疫性疾病發生、發展密切相關[9，15]。大量證據表明B細胞在多發性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、皮肌炎等自身免疫性疾病的發病機制中起著重要作用[3，16-19]。

在自身免疫性疾病中，Bregs的頻率仍然存在爭議。本實驗重點研究GBS患者Bregs的變化，發現與對照組相比，GBS組循環CD19+CD24hiCD38hi和CD19+CD24hiCD27+Bregs 均降低。有利于細胞毒性T細胞對宿主進行攻擊，促進宿主免疫系統的下降，這與之前系統性紅斑狼瘡、血小板減少癥的研究結果一致[20-21]。CD19+CD24hiCD27+Bregs 主要抑制T細胞的活化，這是B細胞自身抗體產生的必要條件[13]。筆者發現，GBS患者源性CD19+CD24hiCD27+Bregs在抑制CD4+T細胞增殖和原發性細胞因子分泌方面具有調節作用。這些發現提示，Bregs 通過控制CD4+T細胞活化的功能轉變，參與GBS的發病。

當然，目前各種實驗發現Bregs 存在許多不同的表型，本研究只研究了其中2種表型，尚不足以完全代表Bregs，且本實驗的研究人群較少，患者來源群體單一，無法完全代表所有GBS患者，故本實驗僅作為參考，仍需大樣本隨機對照實驗進一步明確結論。而且本實驗只是研究了GBS 急性期的CD19+CD24hiCD38+Bregs及CD19+CD24hiCD27+Bregs，限于資金及研究時間限制，未對GBS 恢復期患者進一步研究對照，所以實驗相對單一。以后筆者將對患者恢復期的不同時機作進一步研究，以更加有效地證實研究結果。

綜上所述，Bregs在維持免疫耐受和免疫平衡中有重要的作用。CD19+CD24hiCD38+Bregs及CD19+CD24hiCD27+Bregs 可能參與GBS的發病，但具體的機制尚不明確，有待進一步研究。