TBX5基因靶序列單核苷酸多態性與先天性心臟病的關系*

[山東第一醫科大學（山東省醫學科學院），山東 泰安 271016]

先天性心臟病（congenital heart disease,CHD）作為病因未明的多基因遺傳病，發病率逐年上升，給家庭與社會帶來巨大的經濟負擔[1-4]。TBX5屬于T-box基因家族一員[5-7]，與心臟正常發育有關[8-9]。研究表明，基因3'非翻譯區受microRNA（miRNA）靶向調控，miRNAs 靶序列單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNP）可通過影響靶基因表達水平進而影響個體對疾病的易感性。但關于TBX53'非翻譯區SNP與CHD的相關性研究尚不多見。本研究對TBX53'非翻譯區SNP與CHD 易感性的關系進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年12月—2015年5月在山東大學齊魯兒童醫院就診的186例部分單純CHD患兒（病例組）。所有病例經臨床診斷、心臟彩超診斷、X 射線或CT 影像檢查（優先考慮前兩個診斷），且排除心血管之外的畸形和無家族遺傳史的非綜合征CHD患兒。所有對照為本院同期兒童保健科就診的200例健康體檢兒童（對照組），均排除遺傳性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標簽SNP的選取 ①獲取TBX5基因及區域內的SNP 信息：首先從GenBank 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）獲取人類TBX5基因的染色體位置及序列信息，之后從HapMap 數據庫（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）選 擇Project Data HapMap Genome Browser release #28（phases 1,2 & 3-merged genotypes & frequencies）獲得中國北京漢族人中TBX5基因SNP位點的基因型數據；②將獲得的中國北京漢族人群中TBX5基因所有SNP位點基因型數據分別導入Haploview 4.2，找出最小等位基因頻率（minor allele frequency,MAF）≥5%的常見SNP，計算各個基因內SNP位點間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium,LD）程度數據（r2值），根據r2值大小構建Block 圖譜并篩選具有代表性的標簽SNP位點；③標簽SNP 選擇：根據列出每個單倍域內r2≥0.8的SNP，然后選出與Block 內其余SNP 之間r2≥0.8個數最多，且r2平均值最大一個位于3'非翻譯區的SNP作為標簽SNP，如若同時有多個SNP 符合條件，則結合本次研究目的優先考慮3'非翻譯區的標簽SNP。

1.2.2TBX5基因3'UTR qPCR-HRM 擴增 提取研究對象外周靜脈血基因組DNA，通過查詢NCBI GenBank 獲得TBX5基因3'非翻譯區原始序列，并以此為基礎，利用在線Primer 5.0軟件設計高分辨率熔解曲線所需引物，在LightCycler? 96 熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）上進行擴增。反應體系總體積10μl：基因組DNA 1μl，Mg2+1.6μl，高分辨率熔解曲 線（high resolution melting analysis,HRM）Master Mix 10μl，正、反向引物各1μl，雙蒸水5.4μl。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，65℃退火15 s，60℃延伸15 s，45個循環。HRM分析：95℃預變性1 min，40℃變性1 min，65℃退火1 s，65℃～97℃（0.07℃/s），37℃冷卻30 s。反應結束后，通過LightCycler? 96軟件中的High Resolution Melting模塊對結果進行分析，基因分型。

1.2.3 PCR 產物測序 隨機選取利用HRM 成功分型的TBX5基因rs883079位點3個基因型G/G、G/A及A/A 各10個樣本，應用Sanger雙脫氧鏈終止法進行測序，測序結果與HRM分型結果進行比對。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，計算基因各個多態性位點的基因型頻率和等位基因頻率；運用Hardy-Weinberg平衡在線檢測程序檢驗研究樣本是否具有群體代表性；比值比（odds ratio,OR）及其95% CI 以非條件Logistic 回歸分析計算，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組性別、年齡比較

兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 標簽SNP 篩選

根據基因內SNP 之間連鎖不平衡程度，采用HaploView軟件構建TBX5基因SNP間的Block圖。HaploView軟件運行結果顯示，TBX5基因內共構成 5個Block，且結果只有SNP rs883079 符合預設篩選3'非翻譯區標簽SNP 條件。見圖1。

2.3 TBX5 等位基因分型結果

以經過測序的野生型DNA 樣品作為標準品，HRM分析檢測TBX5基因目的片段。選取HRM 3種分型樣品進行測序驗證，測序峰圖證實TBX5基因3'非翻譯區rs883079位點存在3種基因型，且與HRM結果一致。見圖2、3。

圖1 TBX5基因構建Block

2.4 TBX5基因多態位點各基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測比較

圖2 qPCR-HRM 基因分型

TBX5基因多態位點各基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測比較，差異無統計學意義（χ2=0.378，P=0.539）。TBX5基因rs883079（G＞A）基因型在對照組中分布符合Hardy-Weinberg平衡，可認為對照組人群來自總體人群，不存在選擇性偏倚，具有群體代表性。見表1。

2.5 兩組TBX5 等位基因頻率分布比較

兩組TBX5等位基因頻率分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。突變等位基因A 為CHD的危險性基因（P＜0.05）；攜帶A/A 基因型的個體相對于攜帶G/G 基因型者患CHD的危險性增加，提示A/A 可能為CHDs的危險基因型。見表2。

2.6 TBX5基因多態性與不同類型CHD的關系

圖3 TBX5基因rs883079位點3種基因型測序圖

表1 TBX5基因多態位點各基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測比較 %

按照CHD 具體表型分層，對TBX5基因標簽SNP rs883079 進行分析發現，盡管rs883079 突變純合子A/A 基因型與CHD 易感性相關，但其風險程度在不同類型的CHD 中仍有差異。TBX5基因rs883079（G＞A）位點中，以攜帶G/G 野生純合子基因型者為對照，攜帶突變純合子基因型A/A的個體患間隔缺損的危險性升高。對于室間隔缺損患兒，以攜帶G/G 野生純合子基因型者為對照，TBX5基因rs883079 多態，G/A 基因型、A/A 基因型或是G/A+A/A 基因型均未見該位點與室間隔缺損有統計學關聯。對于房間隔缺損患兒，以攜帶G/G 野生純合子基因型者為對照，TBX5基因rs883079 多態無論是A/A 基因型或是G/A+A/A 基因型都與CHD 風險相關（P＜0.05）。提示TBX5的該非編碼區多態主要與CHD 房間隔缺損相關，或是其危險因素。見表3。

表2 SNP位點等位基因和基因型在病例組和對照組中的分布

表3 TBX5基因多態性與不同類型CHD的關系

3 討論

隨著分子遺傳學的發展，CHD 遺傳因素的作用受到了越來越多的重視。心臟發育相關的轉錄因子在CHD 發病機制中的重要作用已在一些生物模式中得到證實。與心臟發育密切相關的轉錄因子異常可導致嚴重的CHD。TBX5是心臟早期發育過程中極為重要的轉錄因子之一，能通過與另外2個轉錄因子GATA4、NKX2-5在基因和蛋白水平上相互作用，調節心室特化、房室分隔等一系列心臟發育過程[10]。

SNP與疾病易感性的研究已廣泛報道[11]。CHD與SNP 遺傳多態性的研究是近年來CHD 病因研究的熱點與重點之一。已有研究發現，一些位于TBX5基因SNP 同心臟相關疾病有關。LIU 等[12]對192例中國漢族室間隔缺損患兒研究結果顯示，在TBX5基因找到與室間隔缺損易感SNP（rs11067075）。SINNER 等[13]對心房顫動患者研究發現，TBX5基因rs10507248 多態與心房顫動有關。王鳳等[14-15]對室間隔缺損患兒和健康對照的TBX5基因3'非翻譯區相關SNP 進行基因分型和關聯分析，結果顯示TBX5基因3'非翻譯區rs6489956（C＞T）多態位點可增加室間隔缺損的發病風險，功能研究發現T 等位基因能增強miR-9和miR-30a的負向調控，導致TBX5基因的表達差異。

本研究測序驗證發現，與HRM 結果一致。筆者基于病例對照研究設計，依據基因分型結果探討rs6489956（C＞T）位點SNP與CHD的關聯，該位點基因型在兩組分布比較有差異。筆者依據CHD的具體表型進行分層分析，發現對于房間隔缺損患兒，TBX5基因rs883079 多態性A/A 基因型或是G/A+A/A基因型相對于G/G 野生純合子基因型者有增加CHD發病的風險，未發現該位點多態性與室間隔缺損之間的關聯，猜測TBX5rs883079位點SNP 可能是CHD房間隔缺損的危險因素。

有證據顯示，TBX5基因rs883079位點與心臟生理活動有關。一項GWAS 研究發現，該位點與QRS時限和心室傳導有關[16]。PAZOKI 等[17]在心室顫動的一項研究中也表明該位點與心電圖QRS 時限相關。POLYMIRTS 數據庫預測當多態性位點rs883079 等位基因為G 時，只有hsa-miR-132-5p 可能靶向結合該區域，當等位基因為A 時，包括hsa-miR-1231在內的11個miRNA 可能靶向結合[18-19]。因此，當rs883079位點等位基因發生改變時，可能會影響這些miRNA的靶向調控，引起TBX5基因在翻譯水平的改變，從而影響心臟發育，導致CHD的發生。有關TBX5基因rs883079位點SNP與CHD，特別是室間隔缺損關系的分子機制還有待進一步行分子實驗來驗證。