asm基因表達量與安絲菌素P-3產量相關性分析

朱佳琪，王微，朱晨，陳飛3，，程宏3，，馮寶民，劉剛，陳惠鵬

1.大連大學，遼寧 大連 116622；2.廊坊師范學院，河北 廊坊 065000；

3.安徽大學，安徽 合肥 230601；4.軍事科學院 軍事醫學研究院，北京 100850

安絲菌素（ansamitocins）是由珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum）生產的美登素類生物堿，是一種聚酮大環內酰胺苯安莎類抗生素[1-2]，1977年首次由Hgashide等在諾卡菌的發酵液中分離得到[3]。安絲菌素類化合物共有20多種[4]，其中在大環母核C-3位側鏈連接有異丁?；陌步z菌素 P-3（ansamitocin P-3，AP-3）為發酵液中的主產物，含量最多，抗腫瘤活性最強。AP-3不僅對腫瘤細胞微管蛋白聚合有強烈的抑制作用[5]，同時表現出可誘導激活基于免疫的抗腫瘤機制[6-7]，目前以AP-3為化學前體合成的抗體偶聯藥物已經獲批上市用于治療乳腺癌[8]。

安絲菌素的生物合成主要分為三個階段，第一階段由葡萄糖進入糖酵解（EMP）途徑生成的葡萄糖-6-磷酸（G6P）經葡萄糖磷酸變位酶轉化為葡萄糖-1-磷酸（G1P），在谷氨酰胺參與下經莽草酸途徑合成3-氨基-5羥基苯甲酸（AHBH）[9-10]；第二階段由AHBH經asmA、asmB、asmC和asmD編碼依次添加乙酸、丙酸和羥基乙酸合成單元形成安絲菌素母環結構[11]；第三階段由安絲菌素母環經氯代、甲基化和?；群笮揎棽襟E最終合成為AP-3[12]。

安絲菌素的代謝調控包括基因asm1～asm48參與結構域載入的催化與調控、基因asmA～asmD負責AHBH聚酮碳鏈的延伸，兩部分共同分布在AP-3生物合成的2條合成基因簇上[10]，其中還有一些基因的功能尚不明確。本研究選取asm合成基因簇中6種功能尚不明確的基因，通過實時定量PCR檢測這些基因在AP-3生產過程中的動態表達，分析其與AP-3產量的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

珍貴束絲放線菌橙色亞種（A.pretiosumATCC31565）（本實驗室）；安絲菌素P-3標準品（Enzo）；色譜級甲醇（Thermo Fisher）；QuantScript RT Kit、RealMaster Mix（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）；TRIzol試劑（Invitrogen）；Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶、dNTPs（NEB）；DNA marker（TaKaRa）；溶菌酶（Solarbio）。

ISP2培養基（g/L）：酵母粉4，麥芽提取物10，葡萄糖4，瓊脂粉20，110℃滅菌20 min。種子培養基（g/L）：酵母提取物4，麥芽糖10，葡萄糖4，NaCl 1.5，110℃滅菌20 min。發酵培養基（g/L）：酵母提取物4，麥芽糖10，可溶性淀粉20，NaCl 1.5，121℃滅菌20 min。

Symmetry Columns C18色譜柱、600高相液相色譜儀（Waters）；DNA Engine PTC-200 PCR儀、IQ5實時熒光定量 PCR儀（Bio-Rad）；Nanodrop 2000核酸定量分析儀（Thermo Fisher）。

1.2 AP-3檢測與提取方法

采用高效液相色譜（HPLC）法檢測AP-3，固定相為Symmetry Columns C18色譜柱，流動相為超聲脫氣的甲醇/水（體積比85∶15），流速1 mL/min，柱溫28℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。

用色譜級甲醇配制AP-3標準品的標準溶液，制作標準曲線，稀釋為25、50、125、250、500、750、1000 mg/L的標準溶液分別進行HPLC檢測，每濃度重復進樣3次。以標準品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，直線擬合方程為y=14520x，R2=0.997。

將斜面培養的放線菌孢子刮下接種于種子培養基中搖制種子液，種子液以2%接種至發酵培養基進行發酵培養得到AP-3的發酵液。發酵液經等體積乙酸乙酯重復萃取3次，集中萃取液50℃旋轉蒸干，以500 μL色譜級甲醇定容，通過0.22 μm微孔濾膜后進行HPLC檢測，根據標準曲線計算發酵液中的AP-3含量。

1.3 反轉錄合成cDNA

采用TRIzol法提取放線菌總RNA，用Nanodrop 2000核酸定量分析儀檢測濃度后，用北京天根生化有限公司的反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.4 引物設計

在NCBI網站檢索安絲菌素生物合成基因簇中相關未知基因和調控基因序列，利用軟件設計對應的引物（表1），進行25 μL體系的普通PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像儀拍照。

表1 引物及序列

1.5 實時熒光定量PCR

擴增的基因經鑒定后進行實時熒光定量PCR分析。以16S rRNA為內參基因，培養1～7 d每天分別提取的放線菌cDNA為模板，與放線菌培養第 1 d 的 cDNA 相比，用 E-ΔΔCt法分析各基因在不同時間的相對表達水平。

1.6 相關性分析

對基因相對表達量與AP-3產量數據進行Pearson相關性分析，計算Pearson相關系數，用以反映二者的相關性。

2 結果

2.1 發酵液中AP-3含量檢測

放線菌液體搖瓶連續發酵10 d，每24 h取樣，經乙酸乙酯3次萃取后旋轉蒸干，再經色譜級甲醇溶解定容后通過濾膜進行HPLC檢測發酵液中AP-3的含量，在發酵第7 d時AP-3產量達到最高，約70 mg/L（圖1）。

圖1 安絲菌素P-3產量

2.2 引物的特異性驗證

束絲放線菌的基因組內有較高含量的GC堿基對，因此采用高GC含量擴增效果更好的Q5 High-Fidelity DNA聚合酶進行PCR實驗。在進行實時熒光定量PCR前，進行了普通PCR擴增，應用瓊脂糖凝膠電泳對擴增效果與引物特異性進行檢測。由圖2可看出，所選基因經過普通PCR的驗證，均可擴增出單一目的條帶，說明對應引物具有特異性，可以滿足后續實時熒光定量PCR的需要。

圖2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3 實時熒光定量PCR檢測基因表達量

以16S rRNA為對照，實時熒光定量PCR檢測各基因的表達量，應用E-ΔΔCt法分析各基因不同時間點的表達水平。結果表明，asm2和asm36基因表達量隨時間的增加而提高（圖3A、E）；asm30基因表達水平最高出現在第6 d，隨后降低（圖3D）；asm20和asm39基因表達在早期維持低水平，第7 d達到高點（圖3B、F）；asm28基因在第4 d表達水平較高，之后快速下降（圖3C）。

圖3 asm基因相對表達量

2.4 基因表達量與AP-3產量相關性分析

分析表明，asm2和asm36基因表達量與AP-3產量具有顯著正相關性（P＜0.001，圖 4A、E）；asm20和asm39基因表達量與AP-3產量具有正相關性（P＜0.05，圖4B、F）；asm28和asm30基因表達量與AP-3產量未表現出明顯相關性（圖4C、D）。

圖4 asm基因相對表達量與AP-3產量相關性分析

3 討論

安絲菌素的天然發酵產率較低，目前國內外研究者提高其產量主要通過對發酵工藝優化和合成途徑改造兩大方面來實現。在安絲菌素生物合成途徑中，已證明asm基因簇內較多基因功能直接決定AP-3的結構與產量，但仍有一些相關基因的功能尚不清楚。研究這些基因的表達與安絲菌素合成之間的關系，可以為提高安絲菌素產量的生物學改造提供候選基因。我們發現在安絲菌素生產過程中，asm2和asm36基因的表達與安絲菌素產量顯著正相關；asm20、asm30和asm39基因的表達在安絲菌素生產后期顯著升高；而asm28基因的表達在生產早期迅速升高，在后期降低。Ng等[13]的研究表明，asm2和asm39基因過表達菌株，其AP-3產量分別提高1.6和2.5倍；而Ning等[14]的研究顯示，asm30基因失活使AP-3產量提高66%。結合我們的結果，可以發現在AP-3生產過程中，表達量與AP-3產量呈正相關的基因對AP-3的產量呈現正向調控作用，如asm2和asm36。對于asm30基因，我們的研究表明其在AP-3生產早期表達上升，第6 d達到高點后下降，而AP-3產量在第7 d顯著升高。這與Ning的研究相符合，提示在早期抑制該基因活性可以縮短宿主菌發酵周期，提高安絲菌素產率。

本研究結果與文獻報道的相關結論具有很好的一致性。我們猜測某些asm基因的表達量與AP-3產量的相關性可以揭示該基因對于AP-3合成的調控功能，為今后提高AP-3產量的合成途徑改造提供了候選基因，進一步明確其調控AP-3合成的基因功能，為后續AP-3產量的提高奠定基礎。