海南特有極小種群植物文昌錐的SCoT-PCR體系建立及有效引物評價

楊立榮 孫秀秀 陳加利 云 勇 陳 宣 鄭道君*

(1.海南省農業科學院熱帶園藝研究所，海口 571100； 2.海南省熱帶特種經濟植物種質資源創新利用重點實驗室，海口 571100)

文昌錐(Castanopsiswenchangensis)俗稱“杠酸”“油酸”為殼斗科(Fagaceae)錐屬(Castanopsis)植物，僅分布于海南文昌東北部常綠季雨林地區[1]。文昌錐堅果淀粉含量在60%～80%，其味美可口，營養價值高，在文昌及海口地區食用歷史悠久，為優良的特色干果經濟樹種資源，具有良好的開發前景。文昌錐分布范圍小，居群數量少，個體數量少，為海南特有的極小種群物種。野外調查僅發現7個文昌錐居群，全部的個體數量700株左右。文昌錐是其群落中的優勢種或建群種之一，對穩定脆弱的海南島東北部常綠季雨林生態系統具有重要意義[2]。文昌錐主要分布在土壤貧瘠的沙地，生長環境惡劣，且其資源及生境經常受到臺風干擾和人為破壞，種質資源數量日趨變少。因此，文昌錐種群的保護和擴種迫在眉睫，本研究系統地從文昌錐種群生態、生殖生態、種群遺傳等方面進行研究，對揭示文昌錐種群進化歷史及有效保護和恢復該種群具有重要作用。目前針對文昌錐種群保護生物學方面的研究幾乎處于空白。

目標起始密碼子多態性(start codon targeted polymorphism，SCoT)標記是Collard和Mackill在2009年開發的一種新型單引物擴增的分子標記技術[3～4]。該標記是根據基因翻譯起始點(ATG)的側翼序列的一致性和保守性，設計引物擴增目的基因。具有操作簡單方便，引物通用性強，成本低，多態性高，遺傳信息豐富等優點。近幾年已經在柑橘[5]、枇杷[6]、龍眼[7]等植物完成體系建立與優化；在甘蔗[8]、鐵皮石斛[9]、裸果木[10]等植物進行遺傳多樣性與親緣關系的研究；在皂莢[11]、甜橙[12]、馬鈴薯[13]等植物建立種質資源鑒定與指紋遺傳圖譜；在花生[14]、甘蔗[15]、柑橘[16]完成基因差異表達和分子遺傳圖譜的建立。但SCoT標記技術尚未在殼斗科植物上應用。

本研究利用單因子試驗和正交試驗研究文昌錐SCoT分析的最佳反應條件，首次建立了一套穩定的文昌錐SCoT-PCR反應體系并篩選出有效SCoT引物，為后期文昌錐種質資源鑒定、譜系地理學和保護遺傳學等提供技術支持，也對SCoT標記技術應用于其他殼斗科植物研究具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料取自海南省文昌市公坡鎮龍飛頭村文昌錐居群和海南省文昌市昌灑鎮寶彩山村文昌錐居群，材料編號依次為：LFT-01、BC-02和BC-20。取健康葉片用硅膠干燥保存備用。實驗材料憑證標本編號LFT-001(19.800054N，110.845677E，海拔33.1 m)，憑證標本現存放于海南省農業科學院熱帶園藝研究所實驗室。

1.2 基因組DNA的提取

采用FOREGENE試劑盒提取文昌錐的葉片DNA。紫外分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量，將葉片所獲的基因組DNA樣品濃度稀釋到20 ng·μL-1保存在-20℃冰箱備用。

1.3 SCoT-PCR反應體系的優化與建立

1.3.1 單因素試驗設計

80條SCot引物根據Collard[3]和Luo[17]設計，由北京諾塞基因組研究中心有限公司合成。以LFT-01基因組DNA為模板，選用引物組合SCoT5(序列為：CAACAATGGCTACCACGA)，初始反應條件為2×PCR buffer 2 μL，Taq DNA聚合酶1 U，dNTPs 0.3 mmol·L-1，引物濃度0.8 μmol·L-1和模板DNA 40 ng，用ddH20補足到20 μL。擴增程序為94℃預變性5 min，94℃變性1 min，54℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物放于4℃保存。保持其他因素不變的情況下變換一種因素的濃度進行擴增(表1)，篩選適宜的濃度范圍用于正交試驗。

表1 SCoT-PCR單因素試驗設計

Table 1 SCoT-PCR single factor experiment design

試驗水平Test level模板DNATemplate DNA(ng)引物Primer(μmol·L-1)dNTPs(mmol·L-1)Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase(U)10.00.050.0250.0522.50.100.0500.2535.00.200.1000.50410.00.300.2000.75520.00.400.3001.00630.00.500.4001.50740.00.600.5002.00850.00.800.6003.00960.00.900.8004.001070.01.001.0005.00

1.3.2 正交試驗設計

基于單因素試驗結果，進行L16(45)方案的正交試驗[18]，確立最優反應體系。參照鄭道君等[16～17]的直觀分析法，根據擴增條帶的清晰度和豐富度對16個組合的擴增結果進行打分，最優擴增結果為16分，最差為1分。分別進行兩次獨立計分，取兩次的平均數。進行極差R值分析。

1.4 SCoT-PCR反應體系驗證和多態性引物評價

以LFT-01的基因組DNA為模板，采用優化建立的反應條件，對80個SCoT引物進行初選，選擇擴增條帶3條以上的引物進行復選。

以3份地理距離相差較遠的文昌錐資源(LFT-01、BC-02、BC-20)的基因組DNA為模板，以多態性比率(PPB)為主要評價標準，對初選獲得的SCoT引物進行多態性評價和復選，并進行反應體系穩定性驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 模板DNA的用量對SCoT-PCR的影響

如圖1所示，文昌錐基因組DNA的濃度對SCoT-PCR擴增影響差異顯著。DNA用量為2.5～50.0 ng(圖1：泳道2～8)時擴增條帶豐富且清晰穩定；當DNA的用量達到60 ng以上時(圖1：泳道9～10)，擴增強度降低和擴增產物減少，在泳道10(DNA用量為70 ng)僅擴增獲得1條550 bp的產物。可見，文昌錐基因組DNA的用量越多，對SCoT-PCR反應效率就越差。經初選，確定2.5～20.0 ng為SCoT-PCR的適宜DNA濃度范圍，用于正交試驗。

2.1.2 引物濃度對SCoT-PCR的影響

引物是PCR反應中的重要原料之一，引物濃度過低時擴增產物少或沒有，引物濃度過高時反應的特異性降低[18]。本試驗結果表明，設計的濃度范圍內，引物濃度越高時，文昌錐SCoT-PCR擴增效果越好(圖1：泳道11～20)。引物濃度小于0.2 μmol·L-1時無擴增產物；當引物濃度為0.2 μmol·L-1(圖1：泳道13)時僅擴增1條大于2 000 bp的產物；當達到在0.5 μmol·L-1及以上濃度(圖1：泳道16～20)時達到穩定，擴增條帶多且條帶清晰。因此，選擇引物濃度范圍0.5～1.0 μmol·L-1作為正交試驗設計的適宜濃度。

圖1 DNA模板用量和引物濃度對SCoT-PCR反應體系的影響Fig.1 Effect of template DNA concentration and primer concentration on SCoT-PCR reaction system M. 100 bp DNA marker; 1-10. 0,2.5,5,10,20,30,40,50,60 and 70 ng(DNA); 11-20. 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8,0.9 and 1.0 μmol·L-1(Primer)

2.1.3 dNTPs濃度對SCoT-PCR的影響

dNTPs作為PCR擴增反應的原材料，其濃度過低時，會導致擴增效率低，條帶弱或不產生擴增產物[19]；當濃度過高時，會降低鎂離子與Taq DNA聚合酶的結合效率。隨著dNTPs濃度的增加，SCoT-PCR擴增產物由有到無(圖2)。dNTPs濃度為0.025 mmol·L-1時，泳道1擴增效率低且擴增條帶少。當濃度在0.05～0.30 mmol·L-1范圍內時，擴增條帶豐富且主帶清晰；濃度高于0.3 mmol·L-1，泳道6～10無擴增產物。可見，過高的dNTPs濃度會抑制文昌錐的SCoT-PCR反應。所以選擇0.05～0.30 mmol·L-1范圍為正交試驗設計的dNTPs適宜濃度范圍。

2.1.4 Taq DNA聚合酶用量對SCoT-PCR的影響

由圖2可知(泳道11～20)，當Taq DNA聚合酶濃度低于0.5 U，Taq DNA聚合酶活性低，導致SCoT-PCR反應不完全，泳道11-12沒有擴增產物；隨著酶用量的增加，擴增條帶逐漸增多并清晰，尤其是Taq DNA聚合酶濃度在0.75～2.00 U(圖2：泳道14～17)時擴增效果最好；當高于2 U時，開始出現拖尾現象。因此，選擇Taq DNA聚合酶0.75～2.00 U范圍用于正交試驗設計。

圖2 dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶濃度對SCoT-PCR反應體系的影響Fig.2 Effect of dNTPs concentration and Taq DNA polymerase on SCoT-PCR reaction system M. 100 bp DNA marker; 1-10. 0.025,0.05l,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8,1.0 mmol·L-1 (dNTP); 11-20. 0.05,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0 U(Taq)

圖3 不同正交試驗組合的擴增結果 M. 100 bp DNA marker；1～16. 16個處理，編號與表2一致Fig.3 Orthogonal test combination M. 100 bp DNA marker; 1-16. 16 processing,the number is consistent with Table 2.

表3 SCoT-PCR正交試驗設計表

表4 正交設計結果直觀分析

注：K表示某影響因素在不同水平下的分數；k表示某影響因素在不同水平下的分數平均數；1～4表示某影響因素由低到高的4個水平；R表示極差，某影響因素在各個水平分分數平均數的最大值與最小值之差。

Note:K represents the score of a certain influencing factor at different levels; k represents the average of the scores of a certain influencing factor at different levels; 1-4 represent the four levels of a certain influencing factor from low to high; R is the difference between the maximum and minimum values of the average of the scores of each of the influencing factors at each level.

2.2 正交試驗設計與分析

在上述單因素實驗基礎上，基于適宜的DNA用量、引物濃度、dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶用量，設計文昌錐SCoT-PCR L16正交試驗表(表3)。從擴增的結果(圖3)看，16個組合均能擴增出產物，組合1，2，3，4，7擴增的條帶較多且清晰，組合8擴增的條帶少且彌散。

依據條帶多少、強弱和清晰度給16個組合的擴增結果進行打分，分數依次為13，16，15，14，3，10，13，1，4，4，6，3，4，3，4，3，8，9。組合2的分數最高，為最佳組合，組合8分數最低，為最差組合。因此，組合2是文昌錐SCoT的最佳反應組合，即總體系為20 μL，DNA含量為2.5 ng，引物濃度為0.8 μmol·L-1，dNTPs濃度為0.2 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶的含量1 U。

根據打分情況分別求出DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶在同一水平下的K值及均值k。并求出同一影響因子在不同水平下平均值的極差R值(表4)。R值大小說明了每個因素對PCR擴增的影響程度，R值越大，影響越顯著。DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶的R值分別為10.25，3.75，4和2.25。可見適宜的DNA、引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶濃度條件下，它們對文昌錐SCoT-PCR擴增結果影響大小為：DNA>dNTPs>引物>Taq DNA聚合酶。

2.3 有效引物篩選及穩定性檢驗

采用上述已優化的反應體系(組合2)，以LFT-01基因組DNA為模板對全合成的80條引物進行初選，獲得40條效果較好的初選引物(擴增獲得3條以上產物)。以文昌錐LFT-01、BC-02、BC-20(地理距離相差較遠)基因組DNA為模板，對40條初選引物進行評價與復選。經復選，獲得15條適合文昌錐的SCoT多態性引物(圖4，表5)。共有15條引物的擴增多態性百分率在45.45%～78.57%，擴增得到的條帶個數在7～14條。其中SCoT63擴增條帶最多(14條)，多態性最好(78.57%)。從圖4的擴增效果看，基于最佳反應體系，3份文昌錐均能擴增出清晰的條帶且主帶型穩定，分散性好、重復性高，說明該體系穩定可靠，適用于文昌錐SCoT分析。

表5 經過復選后獲得的15條SCoT引物組合擴增信息分析及最佳退火溫度

Table 5 Amplification information analysis and optimal annealing temperature of 15 SCotT primer combinations obtained after re-selection

引物Primers 總條帶數Total number of bands多態性百分率Polymorphism(%)退火溫度Annealing temperature(℃)引物序列Sequence(5′-3′)SCoT81346.1554CAACAATGGCTACCACGTSCoT14955.5660ACGACATGGCGACCACGCSCoT271145.4558ACCATGGCTACCACCGTGSCoT32771.4360CCATGGCTACCACCGCACSCoT411070.0054CAATGGCTACCACTGACASCoT43966.6758CAATGGCTACCACCGCAGSCoT511258.3354ACAATGGCTACCACTGTCSCoT58977.7854ACAATGGCTACCACTAGGSCoT631478.5760ACCATGGCTACCACGGGCSCoT66862.5058ACCATGGCTACCAGCGAGSCoT681050.0058ACCATGGCTACCAGCGTCSCoT731266.6760CCATGGCTACCACCGGCTSCoT751266.6760CCATGGCTACCACCGGAGSCoT761369.2358CCATGGCTACCACTACCGSCoT771250.0058CCATGGCTACCACTACCC

圖4 經過復選后獲得的40條SCoT引物擴增結果Fig.4 Amplification results of 40 SCoT primers after re-selection

3 討論

SCoT基于PCR反應的新型目的基因分子標記技術，雖然有操作方便，成本低，多態性高，遺傳信息豐富等優點，但PCR反應是一種復雜的反應體系，受到時間、溫度、循環數和體系中各試劑濃度的影響[6]。所以建立文昌錐的SCoT-PCR最優體系尤其重要。

雖然SCoT分析已經在多個物種上廣泛應用，但不同物種SCoT-PCR反應體系的主要影響因素不同。對于南瓜和辣椒而言，引物濃度是對SCoT-PCR擴增效果影響最主要的因素[20]；對于梨和木薯而言，dNTPs濃度是對SCoT-PCR擴增效果影響最主要的因素[21]；藥用菊花和葛根[22]以Taq DNA聚合酶為SCoT-PCR擴增的最主要影響因素。本研究通過正交試驗直觀分析表明：各因素對文昌錐SCoT-PCR反應體系影響程度大小依次為：DNA>dNTPs>引物>Taq DNA聚合酶。但在其他植物中還未發現DNA濃度是影響SCoT-PCR體系擴增效果的最主要因素。在白檀[23]和光萼荷屬植物[24]的SRAP分析中也發現DNA濃度是影響擴增效果的最主要因素，與本研究結果一致。通過單因素試驗表明：模板DNA濃度對SCoT-PCR擴增影響顯著，本實驗中DNA模板濃度越高，擴增條帶越少產量越低，可能是文昌錐葉片細胞內含有Taq DNA聚合酶反應效率的抑制性物質較多引起。因此，在對包括文昌錐在內的諸多殼斗科植物進行PCR擴增時，需要注意其葉片的DNA溶液中可能含有的Taq DNA聚合酶反應效率抑制性物質。

通過單因素試驗和正交試驗，本研究獲得文昌錐SCoT-PCR的最佳反應體系，即總體系為20 μL，模板DNA含量為2.5 ng，引物濃度為0.8 μmol·L-1，dNTPs濃度為0.2 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶的含量1 U。經驗證，該體系的穩定性好，可靠性高。基于該體系，本研究從80條SCoT引物中篩選出15條多態性在45.45%～78.57%、擴增條帶在7～14條且清晰度高的有效引物。文昌錐SCoT-PCR反應體系的建立和獲得的有效引物，為海南特有極小種群植物文昌錐的資源評價鑒定、保護遺傳學等方面的研究奠定了較好的基礎。