菌酶融合工藝制作高肽發酵豆粕的研究及高肽發酵豆粕在保育料中替代魚粉的應用

王曉明 毛 悅 唐香山 鄧 敦 舒劍成 羅 杰 李 慧

（唐人神集團股份有限公司，湖南株洲 412000）

大豆及其加工副產品因具有較高營養價值而被廣泛應用于食品和飼料工業。 豆粕作為大豆主要副產品之一， 是非常優秀的畜禽植物蛋白飼料原料，蛋白質占40～48%，脂肪占1～2%，碳水化合物占10～15%，并含有多種礦物質、維生素和必需氨基酸，在畜禽日糧中廣泛使用。

但豆粕中也還有很多抗營養因子， 比如蛋白酶抑制因子、不良寡糖、抗原蛋白等，嚴重限制了其在幼齡動物上的應用。從二十世紀初期開始，人們就對大豆中抗營養因子進行研究， 隨著科技的發展， 應用發酵或體外酶解的方法消除豆粕中的抗營養因子，提高豆粕的消化率，從而替代或部分替代日益看漲的動物蛋白（魚粉、血漿蛋白等）已經成為人們研究的熱點。 本文將利用體外酶解和發酵聯合處理的方法， 研究出一種制作高肽發酵豆粕的生產工藝， 并研究此發酵豆粕在保育料中替代魚粉的應用。

1 材料與方法

豆粕顏色淺黃色，烤大豆香味，呈不規則碎片狀，不含過量雜質，粗蛋白46.08%（實測）。

堿性蛋白酶（2.4AU/g，諾維信）、風味蛋白酶（500LAPU/g，諾維信），中性蛋白酶(0.8AU/g，諾維信)、酸性蛋白酶(10 萬U/g)、植物乳桿菌（實驗室篩選菌株）。

試劑：氫氧化鈉、丙烯酰胺、無水酒精、甘氨酸、Tris、考馬斯亮藍R250、甲醇、冰醋酸、甘油、β-疏基乙醇、溴酚蘭、鹽酸、正丙醇、正磷酸等。

儀器：電泳儀、電泳槽、高速離心機、微量進樣器、移液槍、PH 計、硅膠板、層析缸、烘箱、噴霧干燥機。

1.4.1 實驗室指標

（1）水分：參照GB/T 6435-2014 飼料中水分的測定；

（2）粗蛋白：參照GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法；

（3）酸溶蛋白（小肽）：參照GB/T 22492-2008大豆肽粉；

（4）大豆抗原蛋白定性檢測：聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）；按照常規方法配置12%的分離膠和5%的濃縮膠。取酶解豆粕烘干樣品1.0g， 加入20.00ml 0.03mol/L 的Tris-Hcl（ph=8，包括0.01mol/L 的β-巰基乙醇）在室溫下浸泡1 小時（每10 分鐘攪拌一次），然后10000rpm 下離心20 分鐘，取上清液40 微升， 加入10 微升5×樣品緩沖液（5×loading buffer 藍色），沸水浴5 分鐘，然后取10 微升點樣，進行SDS-PAGE 電泳；

（5）發酵豆粕中不良寡糖定性檢測：薄板層析法（TLC）；

利用不同大小的糖分子在硅膠板上的擴散速度的大小不同，將發酵豆粕中的寡糖分開。

①分別稱取寡糖標樣0.01g 溶于80%的乙醇溶液中，4℃保藏備用。

②準確稱取發酵豆粕樣品5.00g 于250ml 三角瓶中， 加入50ml 80%的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。取2ml 浸提液，10000rpm 離心10min，4℃保藏備用。

③在預制硅膠板上點樣，點樣量為5 微升，點樣干燥后在展開液中展開， 展開至離硅膠板前沿2cm 處。 自然晾干后，噴淋顯色液，在140℃下烘5min 顯色。

1.4.2 動物實驗指標

平均日采食量、平均日增重、料肉比、腹瀉率

2 結果與分析

本實驗通過一系列單因素試驗研究了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風味蛋白酶對豆粕中抗原蛋白、酸溶蛋白及酶解液味道的影響，并在單因素的基礎上做了復合酶試驗及菌酶融合聯合處理試驗， 最終確定高肽發酵豆粕制作工藝如下：

豆粕進行超微粉碎→加入自來水， 料水比為1:10→滅菌處理（80℃處理30min）→加入20%的NaOH 溶液， 把酶解液的初始PH 值調節為8.0→加入0.5%堿性蛋白酶、1%風味蛋白酶和0.1%中性蛋白酶（酶添加量以豆粕計）， 保溫50℃酶解4h→加入5%植物乳桿菌菌液和0.1%酸性蛋白酶，37℃發酵48h→低溫干燥→發酵豆粕T （高肽發酵豆粕）

2.2.1 抗原蛋白去除結果

大豆抗原蛋白指大豆蛋白中能夠刺激機體產生抗體，并能與這些抗體結合，引起特異性免疫反應的物質。 大豆種子蛋白中， 大豆球蛋白約占40%，β-伴大豆球蛋白約占30%，α-伴大豆球蛋白約占15%，γ-伴大豆球蛋白約占3%，其中能引起仔豬過敏反應的主要是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。 大豆球蛋白是一種沉淀系數為11S 的球蛋白，β-伴大豆球蛋白是7S 球蛋白， 其中大豆球蛋白主要由酸性亞基A1、A2、A3、A4 和堿性亞基Basic 組成，β-伴大豆球蛋白主要由亞基α’、α 和β 組成。

由圖1 知，使用新工藝生產的發酵豆粕T 中的抗原蛋白已經被全部去除掉， 效果優于目前市售的發酵豆粕、酶解豆粕和膨化大豆。

2.2.2 新工藝生產的發酵豆粕中的酸溶蛋白含量和不良寡糖去除情況

表1 發酵豆粕T 中的酸溶蛋白含量

由表1 和圖2 知， 目前市售的發酵豆粕中的酸溶蛋白含量在8%左右，而使用菌酶聯合處理生產的發酵豆粕T 中的酸溶蛋白含量可以達到36.5%，而且發酵豆粕T 中的水蘇糖和棉子糖也被全部去除掉了。

由以上實驗結果知， 使用菌酶融合工藝生產的發酵豆粕T， 其酸溶蛋白含量可以達到36.5%（是目前市售發酵豆粕的4 倍）， 而且其中的大豆抗原蛋白和不良寡糖也被全部去除。

選擇8～9kg 保育豬150 頭，按體重相近、性別一致原則隨機分為2 個處理組， 每個處理5 個重復，每個重復15 頭豬。分別飼喂兩種試驗日糧：對照組（魚粉組），實驗組（使用發酵豆粕T 替代魚粉）。 試驗期間，安排專人負責飼養，自然通風，自由采食飲水，保持欄舍清潔衛生。試驗過程中發現試驗豬生病，及時治療，3 天內不能康復即淘汰，進行為期12 天試驗。

由表3 知， 對照組和實驗組之間的平均日采食量、 平均日增重、 料肉比和腹瀉率沒有明顯差異，而且實驗組的平均日增重還略高于對照組，料肉比也降低了0.12。

試驗結果表明，在保育料中可以使用4%的發酵豆粕T 替代3%的魚粉，而不會降低仔豬的生長性能。

3 結論

本實驗研究了菌酶融合制作高肽發酵豆粕的新工藝，經過新工藝制作出的高肽發酵豆粕，不僅可以去除豆粕中的抗原蛋白和不良寡糖， 而且使豆粕中酸溶蛋白含量由2%提高到了36.5%（是普通發酵豆粕酸溶蛋白含量的4 倍）。 經過動物實驗， 在保育料中可以用4%的發酵豆粕T 替代3%的魚粉，而不會降低仔豬的生長性能。

表2 日糧原料組成及主要營養指標

表3 不同試驗料對保育豬生長性能的影響

參考文獻（略）