茵虎清肝方對D-氨基半乳糖脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型大鼠肝損傷的影響*

何 瑜 馬曉星 解 姍

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)棗莊醫(yī)院，山東 棗莊 277000；2.山東省青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東青島 266200）

急性肝衰竭（AHF）是指由多種因素引起的肝細(xì)胞大面積死亡或嚴(yán)重肝功能損傷一種臨床綜合征，可進展為肝性腦病多器官功能衰竭危及生命，可出現(xiàn)肝功能異常、黃疸、肝臟生化指標(biāo)異常、凝血功能障礙等［1］。嚴(yán)重或持續(xù)的肝損傷是導(dǎo)致AHF發(fā)病的原因，早期干預(yù)對AHF尤為重要。AHF發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。中醫(yī)在臨床治療AHF過程中發(fā)揮了重要作用。抗炎保肝是目前AHF研究的熱點［2］。現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為“毒邪-毒濁”肝衰竭是致病因素［3］。茵虎清肝方具有清熱解毒、活血化瘀之功效，是筆者所在醫(yī)院治療AHF的臨床經(jīng)方。本研究通過腹腔注射D-氨基半乳糖脂多糖誘導(dǎo)大鼠建立急性肝衰竭模型，通過研究茵虎清肝方對AHF病理組織形態(tài)、炎癥因子、氧化應(yīng)激以及肝臟纖維化指標(biāo)的影響，旨在探討茵虎清肝方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只健康SPF級Wistar大鼠，8周齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供［SCXK（京）2014-003］，雌雄各半，體質(zhì)量（250± 20）g。本研究經(jīng)筆者所在醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合中國倫理委員會指導(dǎo)原則。

1.2 藥物與試劑 茵虎清肝方：虎杖30 g，金銀花12 g，茵陳15 g，黃連9 g，白花蛇舌草6 g，蒲公英9 g，野菊花6 g，紫花地丁6 g，丹參9 g，瓜蔞12 g，枳實9 g，甘草、法半夏各3 g。藥材回流提取，最后濃縮成1 g/mL的煎煮液，放涼后待用。D-氨基半乳糖脂多糖由美國Sigma公司提供。安宮牛黃丸（北京同仁堂有限公司，批號20180918，國藥準(zhǔn)字Z11020076），水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20180910），隱血試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供，C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、總膽紅素（TBIL）由Roche有限公司提供。超氧歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 分組與給藥 60只大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性組、實驗組，每組15只。各組大鼠在自然光線，以標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌蒸餾水喂養(yǎng)。陽性組給予安宮牛黃丸0.3 g/kg灌胃；實驗組給予茵虎清肝方10 g/kg灌胃，連續(xù)7 d。對照組和模型組均給予同體積的蒸餾水灌胃。

1.4 模型制備 7 d給藥結(jié)束后開始進行造模。對照組未經(jīng)任何處理，其余各組大鼠參考文獻(xiàn)［4］制定急性肝衰竭模型大鼠模型：腹腔注射D-氨基半乳糖（DGalN，700 mg/kg）/脂多糖（LPS，10 μg/kg），作用 6 h后即完成建模。通過大鼠的肝功能水平和肝臟組織的病理改變情況判定造模是否成功。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）肝組織病理變化觀察。成模后7 d，斷頭處死大鼠，取肝大葉部分組織，固定于10%甲醛溶液中，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，制作2～3張切片，于顯微鏡下進行病理學(xué)檢查。2）肝功能檢測。采用全自動生化分析儀檢測ALT、GOT及TBIL，記錄肝臟指數(shù)。3）炎癥因子、氧化應(yīng)激和肝纖維化指標(biāo)檢測。處死大鼠后，取大鼠腹動脈血液樣品3 mL，離心，分離血清，ELISA法檢測CRP、TNF-α、IL-6炎癥因子水平，SOD、MDA、GSH嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。用放射免疫分析透明質(zhì)酸酶（HA）層黏連蛋白（LN）Ⅲ型前膠原（Ⅲ-PC）和Ⅳ型膠原Ⅳ（Ⅳ-C），嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料以n（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肝衰竭病理學(xué)觀察 對照組大鼠的肝細(xì)胞排列均勻規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰。模型組肝細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞水腫變性壞死，肝索紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，肝竇區(qū)擴張并充血。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)稍紊亂，肝細(xì)胞腫脹減輕，壞死肝細(xì)胞減少，結(jié)節(jié)狀也少，纖維組織減少，兩組大鼠的肝臟病理學(xué)無明顯區(qū)別，見圖1。

2.2 各組肝臟功能以及肝臟指數(shù)比較 見表1。與對照組比較，模型組大鼠的ALT、GOT、TBIL以及肝臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組的ALT、GOT、TBIL以及肝臟指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠ALT、GOT、TBL以及肝臟指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠ALT、GOT、TBL以及肝臟指數(shù)比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性組比較，△P＜0.05。下同

組別對照組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 ALT（U/L）50.68±9.85 410.87±30.81*265.68±26.67*#244.11±24.59*#△GOT（U/L）41.21±8.69 391.61±31.18*204.35±29.21*#189.07±21.16*#△TBIL（U/L）2.39±0.42 108.23±7.28*40.78±5.38*#38.14±4.66*#△肝臟指數(shù)1.26±0.25 3.62±0.49*2.37±0.46*#2.19±0.45*#△

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表2。與對照組比較，模型組大鼠的SOD和GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高；藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組大鼠SOD和GSH含量明顯升高（P＜0.01），MDA含量明顯降低（P＜0.05）。陽性組和實驗組大鼠的SOD、GSH和MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠SOD、GSH和MDA含量比較（±s）

表2 各組大鼠SOD、GSH和MDA含量比較（±s）

組別對照組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 SOD（U/mL）38.57±4.38 17.12±2.36*27.12±3.35*#31.23±3.17*#△MDA（mmol/mL）2.55±0.27 6.12±1.55*3.77±1.05*#3.16±0.76*#△GSH（μmol/L）21.92±3.19 7.09±2.24*13.02±2.38*#15.15±2.43*#△

2.4 各組炎癥因子比較 見表3。與對照組比較，模型組大鼠的TNF-α、IL-1β以及IL-6水平明顯高于對照組（P＜0.05）。給予藥物治療后，陽性組和實驗組的TNF-α、IL-1β以及IL-6水平明顯低于模型組（P＜0.05）。兩組大鼠的TNF-α、IL-1β以及IL-6水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β以及IL-6水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β以及IL-6水平比較（±s）

組別對照組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 TNF-α 159.73±6.09 178.57±7.24*164.39±7.05*#163.15±7.23*#△IL-1β 89.53±4.67 101.72±6.85*94.66±5.54*#93.69±4.71*#△IL-6 91.12±5.67 110.47±8.86*95.57±7.45*#98.87±3.09*#△

2.5 各組肝纖維化指標(biāo)比較 見表4。與對照組比較，模型組大鼠肝纖維化指標(biāo)明顯高于對照組（P＜0.05）。給予藥物治療后，陽性組和實驗組大鼠的HA、LN、Ⅲ-PC以及Ⅳ-C水平明顯低于模型組（P＜0.05）。兩組大鼠的HA、LN、Ⅲ-PC以及Ⅳ-C水平比較有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組大鼠肝纖維化指標(biāo)比較（ng/mL，±s）

表4 各組大鼠肝纖維化指標(biāo)比較（ng/mL，±s）

組別對照組模型組陽性組實驗組n 15 15 15 15 HA 55.12±9.87 271.28±14.26*111.98±13.42*#92.85±3.67*#△LN 75.06±10.47 295.24±12.36*117.37±6.59*#94.64±7.12*#△Ⅲ-PC 63.47±5.17 255.37±29.38*138.03±16.01*#118.24±15.14*#△Ⅳ-C 69.75±5.06 267.42±15.23*81.28±5.04*#75.61±6.19*#△

3 討論

目前，AHF具體發(fā)病機制尚未完全闡明，但病毒感染、氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素血癥以及細(xì)胞因子等因素被認(rèn)為可導(dǎo)致AHF的發(fā)生。腹腔注射D-GalN/LPS誘導(dǎo)AHF大鼠是常用的經(jīng)典AHF模型。LPS是革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素的主要成分，D-GalN可使LPS的急性毒性增強。研究發(fā)現(xiàn)［5］，LPS可刺激大鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的大量釋放，導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)AHF大鼠肝細(xì)胞壞死與凋亡。TNF-α是由活性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進炎癥細(xì)胞聚集活化及釋放炎癥介質(zhì)作用，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，加重炎癥癥狀，是炎癥反應(yīng)的起始因子，亦是急性炎癥相關(guān)指標(biāo)；IL-1β可通過激活內(nèi)皮細(xì)胞增加誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子表達(dá)，誘發(fā)炎性發(fā)應(yīng)，是重要的促炎因子之一，介導(dǎo)了炎癥的重要過程，與TNF-α的釋放相互促進，是引起發(fā)熱等炎癥反應(yīng)的誘因；IL-6參與多種生物學(xué)效應(yīng)因子，導(dǎo)致神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂主要外因之一，直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時機體內(nèi)的ROS和MDA含量上升，可造成肝組織腫脹和壞死處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時機體內(nèi)的ROS和MDA含量上升，可造成肝組織腫脹和壞死［6］。ALF是AHF發(fā)生發(fā)展進程中的重要病理基礎(chǔ)之一，其研究是治療肝臟疾病的一個重要途徑。MDA含量可反映組織過氧化損傷程度。GSH含量反映了機體抗氧化和清除自由基的能力。SOD可消除單線態(tài)氧，是細(xì)胞抗氧化的第一道防線。纖維化是肝病后期的一個重要病理過程，是肝病發(fā)生發(fā)展進程中的一個重要環(huán)節(jié)［7-9］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AHF屬“急黃”“瘟黃”范疇，其主要病機毒瘀痰，毒為病因，貫穿于疾病的始終，瘀為病變之本，且互為因果，形成惡性循，治療亦清毒化瘀祛痰。茵虎清肝方具有清熱解毒、活血化瘀之功效［10-11］。其組方中虎杖清熱解毒退黃、散瘀止痛，茵陳清熱解毒、利膽退黃，兩藥合用清熱解毒、化瘀退黃。配以金銀花、黃連、白花蛇舌草、蒲公英、野菊花、紫花地丁增強清熱解毒之效、丹參、瓜蔞、枳實協(xié)同虎杖活血化瘀，甘草、法半夏健脾和胃、止嘔，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用起到清熱解毒、活血化瘀之功效。現(xiàn)代藥理研究表明［12-15］，瓜蔞可明顯減輕平陽霉素所致的大鼠肺泡炎及纖維化程度，抑制肺組織中炎癥因子過度表達(dá)；虎杖中虎杖苷對D-gal致肝損傷具有防治作用，其作用機制可能與提高機體的抗氧化能力，抑制炎癥反應(yīng)和抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)；蒲公英提取物對LPS激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌具有明顯的抑制作用；丹參多糖具有明顯緩解小鼠免疫性肝損傷的作用，其機制可能與拮抗肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低肝組織中炎癥細(xì)胞因子。

本研究結(jié)果顯示，模型組肝細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞水腫變性壞死，肝索紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，肝竇區(qū)擴張并充血。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)稍紊亂，肝細(xì)胞腫脹減輕，壞死肝細(xì)胞減少，結(jié)節(jié)狀也少，纖維組織減少。結(jié)果提示茵虎清肝方可明顯改善AHF大鼠的肝臟病理學(xué)，降低肝損傷。模型組大鼠的ALT、GOT、TBIL、肝臟指數(shù)以及肝纖維化指標(biāo)明顯升高。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組的ALT、GOT、TBIL、肝臟指數(shù)、HA、LN、Ⅲ-PC以及Ⅳ-C水平明顯低于模型組，兩組間比較有顯著差異。結(jié)果提示茵虎清肝方可明顯改善AHF大鼠肝功能，可有效防治肝臟纖維化。模型組大鼠的SOD和GSH含量明顯降低，TNF-α、IL-1β、IL-6水平和MDA含量明顯升高；藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組大鼠SOD和GSH含量明顯升高，TNF-α、IL-1β、IL-6水平和MDA含量明顯降低。陽性組和實驗組大鼠的SOD、GSH和MDA含量、TNF-α、IL-1β以及IL-6水平比較有顯著性差異。結(jié)果提示茵虎清肝方可明顯減少AHF大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低炎癥因子水平。

綜上所述，茵虎清肝方通過抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激，阻斷肝臟纖維化對D-氨基半乳糖脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肝衰竭發(fā)揮保護作用。