溫陽補(bǔ)心湯對(duì)慢性心衰大鼠心肌線粒體能量代謝及MAPK/PPAR-γ信號(hào)通路的影響*

王瑩威 任廣杰 王 博 王殿明 劉璐菲 李敬孝，△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150036）

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟疾病發(fā)展到心功能受損的一種病理狀態(tài)，也是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的重要原因之一。2017年6月《中國心血管病報(bào)告2016》發(fā)布［1］，目前心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，隨著老齡化的進(jìn)展，心力衰竭的發(fā)病率呈上升趨勢。目前中醫(yī)藥治療心衰具有很好療效，中成藥已被2014年中國心衰指南推薦使用［2］。CHF在中醫(yī)學(xué)中屬于“心痹”“心悸”“喘證”“水腫”等范疇，發(fā)病初期心氣虛，逐漸發(fā)展成心腎陽虛，進(jìn)而心之氣血陰陽虛衰，臟腑功能失調(diào)，心失所養(yǎng)，氣虛血瘀，水飲內(nèi)停，又加重心衰。李敬孝教授基于對(duì)該病病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，提出治療當(dāng)以溫陽補(bǔ)心為原則。本研究以溫陽補(bǔ)心湯干預(yù)p38MAPK/PPAR-γ通路CHF模型大鼠，探討在促進(jìn)線粒體結(jié)構(gòu)改變和改善衰竭心肌能量代謝方面的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，48只，體質(zhì)量200～220 g，8周齡，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（黑）2016-0035，嚴(yán)格遵循動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則進(jìn)行統(tǒng)一喂養(yǎng)，自然光照，室溫（25±2）℃。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、攝食，1周后用于模型制備。

1.2 試藥與儀器 琥珀酸美托洛爾由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)J20180045）。溫陽補(bǔ)心湯：制附子10 g，白術(shù) 10 g，生姜 10 g，桂枝 10 g，黃芪 30 g，當(dāng)歸10 g，茯苓 15 g，益母草 20 g，川芎15 g，紅花10 g（藥材由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供）。飲片加入清水煎煮2次，第1次90 min，第2次30 min，然后濃縮為2 g/mL煎劑。三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、氨基末端B型鈉尿肽原（NT-proBNP）的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京卡米洛生物工程有限公司，批號(hào)分別為CEA349Ge，SFA6005AS，CEA3560Ge）；p38MAPK抗體（批號(hào)533216798）、p-p38MAPK抗體（批號(hào)00905860）、PPAR-γ抗體（批號(hào)5890623）。低溫高速離心機(jī)（美國BECKMANCOULTER公司），電泳槽（HE-120型），電泳儀（北京六一儀器廠），彩色多普勒超聲診斷儀（SIEMENS，探頭頻率為3.5）。

1.3 分組與造模 術(shù)前對(duì)48只大鼠進(jìn)行多普勒彩超檢測，確定心功能無異常。采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作慢性心力衰竭大鼠模型。所有大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，予2.5%戊巴比妥鈉注入大鼠腹腔麻醉，手術(shù)板上仰臥位置麻醉，腹部劍突下正中縱向切口，分層打開腹腔，腹主動(dòng)脈鈍性分離，沿腹主動(dòng)脈找到腎動(dòng)脈分支，在此處上方約2 mm，將7號(hào)注射針頭與4號(hào)可吸收手術(shù)線縫合，一起結(jié)扎，抽出針頭，關(guān)腹縫合，形成腹主動(dòng)脈大約50%狹窄，假手術(shù)組僅分離腹主動(dòng)脈，不進(jìn)行縮窄術(shù)，其他操作與模型組相同。術(shù)后將大鼠放置單籠喂養(yǎng)，蘇醒后回籠。術(shù)后4周進(jìn)行多普勒彩超檢測，以左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜45%判定為造模成功，排除死亡與感染，造模成功后，將CHF大鼠隨機(jī)分為模型組、溫陽補(bǔ)心湯組、琥珀酸美托洛爾組，以及假手術(shù)組12只。

1.4 給藥方法 根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表”折算［3］，假手術(shù)組、模型組予0.9%氯化鈉注射液4 mL/（kg·d）灌胃，溫陽補(bǔ)心湯17.5 g/（kg·d）灌胃，琥珀酸美托洛爾4.27 mg/（kg·d）灌胃，各組均每日給藥1次，干預(yù)8周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）ELISA法檢測大鼠外周血中ATP、ADP、NT-proBNP的含量。給藥8周后麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈采血，具體步驟按試劑盒說明進(jìn)行。2）Western blotting法檢測p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ。將100 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，轉(zhuǎn)膜1 h，轉(zhuǎn)膜完畢后，浸入5%脫脂奶粉TBST中避光封閉1.5 h；洗滌后進(jìn)入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜，次晨洗滌后浸入二抗稀釋液中，室溫?fù)u床孵育1 h，孵育結(jié)束，TBST洗脫ECL顯色曝光，分析結(jié)果。3）彩色多普勒超聲檢測大鼠心室功能。末次給藥后，對(duì)大鼠充分麻醉，將其平臥固定，將探頭置于胸骨左緣取左室長軸最大直徑處M型超聲標(biāo)記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內(nèi)膜位置，檢測左心室舒末內(nèi)徑（LVDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVDS）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室舒張末期后壁厚度（LVPWD）、左心室收縮末期后壁厚度（LVPWS），連續(xù)檢測5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料服從正態(tài)分布且方差齊以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中ATP、ADP、NT-proBNP含量的比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組，溫陽補(bǔ)心湯組和琥珀酸美托洛爾組大鼠外周血清中ATP的含量顯著下降，ADP、NT-proBNP含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，溫陽補(bǔ)心湯組和琥珀酸美托洛爾組ATP含量上升，ADP、NT-proBNP含量下降（P＜0.05）。與琥珀酸美托洛爾組比較，溫陽補(bǔ)心湯組的ATP含量上升，ADP、NT-proBUP含量下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠ATP、NT-proBNP、ADP含量比較（±s）

表1 各組大鼠ATP、NT-proBNP、ADP含量比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與琥珀酸美托洛爾組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組琥珀酸美托洛爾組溫陽補(bǔ)心湯組n 12 12 12 12 ATP（μg/L）762.50±180.96 389.39±157.97*466.50±269.60*△583.39±273.46*△▲NT-proBNP（ng/L）25.57±9.32 82.73±21.39*65.86±19.32*△49.17±17.65*△▲ADP（μg/L）235.59±52.43 590.76±121.72*372.45±95.60*△350.20±80.36*△▲

2.2 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組、琥珀酸美托洛爾組和溫陽補(bǔ)心湯組p38MAPK、pp38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），PPAR-γ蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，溫陽補(bǔ)心湯組、琥珀酸美托洛爾組p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），PPAR-γ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。琥珀酸美托洛爾組與溫陽補(bǔ)心湯組比較，上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組琥珀酸美托洛爾組溫陽補(bǔ)心湯組n 12 12 12 12 p38MAPK 0.190±0.019 0.760±0.059*0.632±0.028*△0.419±0.037*△p-P38MAPK 0.079±0.005 0.837±0.062*0.460±0.021*△0.271±0.025*△PPAR-γ 0.793±0.042 0.248±0.017*0.460±0.021*△0.589±0.028*△

2.3 各組大鼠心室功能相關(guān)指標(biāo)的比較 見表3。與模型組比較，琥珀酸美托洛爾組和溫陽補(bǔ)心湯組LVDD、LVDS、LVEF、LVPWD、LVPWS均顯著改善（P＜0.05），且溫陽劑心湯組改善優(yōu)于琥珀酸美托洛爾組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心室功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠心室功能相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組琥珀酸美托洛爾組溫陽補(bǔ)心湯組n 12 12 12 12 LVDD（mm）6.65±0.43 9.79±0.51*8.16±0.48△7.32±0.31△▲LVDS（mm）5.60±0.39 9.57±0.62*7.18±0.42△6.56±0.36△▲LVEF（%）87.64±17.32 36.51±5.68*52.62±6.64△61.23±6.83△▲LVPWD（mm）3.25±0.36 1.97±0.27*2.16±0.39△2.73±0.25△▲LVPWS（mm）4.62±0.63 1.20±0.27*2.13±0.37△2.68±0.51△▲

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中雖未記載“心衰”病名，根據(jù)癥狀可將其歸于“心痹”“心悸”“喘證”“水腫”等范疇，異病同治。多認(rèn)為慢性心衰的病機(jī)關(guān)鍵為陽虛血瘀，故治療原則多以溫陽補(bǔ)心為主，兼以化瘀利水［4］。心衰發(fā)病初期多為心氣虛，氣為血之帥，血為氣之母，氣虛致血液運(yùn)行不暢，導(dǎo)致血瘀，從而加重心臟前后負(fù)荷，病程日久，心氣虛加重，氣虛久及陽虛，腎主相火，又稱“真陽”，心主君火，相火溫養(yǎng)君火，心腎相交，腎陽虛，則氣化不利，水飲內(nèi)停，發(fā)為水腫，腎主納氣，腎氣充足，呼吸才能均勻，另《金匱要略》則開創(chuàng)性地提出了“血不利則為水”的論點(diǎn)［5］，《血證論》在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步指出“血積既久，其水乃成”，由此可以推論出：心氣虛致血瘀，血瘀又加重水停心下，引發(fā)出氣短氣不足以息、水腫、心悸等一系列癥狀［6］。李敬孝教授參考古文獻(xiàn)及現(xiàn)代研究，經(jīng)多年臨床觀察和總結(jié)，結(jié)合現(xiàn)代人飲食習(xí)慣、生活環(huán)境提出“溫陽補(bǔ)心”的治法，運(yùn)用溫陽補(bǔ)心湯溫陽補(bǔ)心，化瘀利水。方中諸藥為真武湯合補(bǔ)陽還五湯加減，附子辛熱，桂枝溫通心陽，化飲利水，配生姜溫化水氣，白術(shù)茯苓以健脾利水，黃芪益氣升陽，利水消腫，中、大劑量黃芪可增加心肌收縮及舒張功能，當(dāng)歸可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞［7］，葶藶子、益母草通利水道，降低心臟負(fù)荷，改善心衰水腫癥狀［8］，川芎對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，減輕缺血引起的心肌細(xì)胞損傷［9］，紅花可增加冠脈血流量，改善心肌缺血［10］。諸藥調(diào)配共奏溫陽化瘀利水之功。

本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備CHF大鼠模型，超聲檢測CHF模型大鼠與假手術(shù)組比較，LVDD、LVDS水平升高，LVEF、LVPWD和LVPWS水平降低，ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較ATP表達(dá)降低，NT-proBNP、ADP表達(dá)升高，慢性心衰大鼠模型造模成功。目前已有研究證實(shí)，MAPK信號(hào)通路與慢性心衰、心肌梗死和心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［11］。研究表明，DHF的發(fā)生常伴隨有線粒體結(jié)構(gòu)改變和功能損傷，引起能量合成障礙，而作為細(xì)胞能量變化感受器的MAPK，在心肌線粒體結(jié)構(gòu)改變中發(fā)揮著重要作用［12］。MAPK/PPAR在機(jī)體內(nèi)是重要的調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)下游多組通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡、能量代謝等從而影響機(jī)體內(nèi)各種疾病的發(fā)生發(fā)展［13］。p38MAPK作為MAPK家族的一個(gè)成員，是細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，幾乎與生物體中全部病生理過程有關(guān)，尤其是炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等細(xì)胞反應(yīng)過程。p38MAPK主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，正常生理狀況下活性較低，可調(diào)控基因表達(dá)及抗氧化損傷等［14］。p-p38MAPK轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，可磷酸化激活許多轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多類靶基因［15］。Western blotting結(jié)果顯示，CHF大鼠與假手術(shù)組比較p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)上升，說明在CHF發(fā)生后，p38MAPK磷酸化作用過程加強(qiáng)，琥珀酸美托洛爾和溫陽補(bǔ)心湯干預(yù)后p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)較模型組比較降低，說明p38MAPK磷酸化過程被抑制。PPAR-γ屬于核因子超家族成員，為調(diào)節(jié)大量基因表達(dá)所必需的核受體［16］，研究結(jié)果顯示，CHF大鼠與假手術(shù)組比較PPAR-γ表達(dá)下降，說明在CHF發(fā)生后，PPAR-γ通路被抑制，琥珀酸美托洛爾和溫陽補(bǔ)心湯干預(yù)后，PPAR-γ表達(dá)較模型組上升，PPAR-γ蛋白被激活。

本研究表明，溫陽補(bǔ)心湯通過抑制p38MAPK、pp38MAPK蛋白，激活PPAR-γ通路，通過參與線粒體生物合成，調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和質(zhì)量，促進(jìn)能量生成，改善心臟能量代謝，進(jìn)而改善心衰進(jìn)展。