青脆李果酒發酵及澄清工藝研究

曾順德，商桑，高倫江，曾小峰，尹旭敏，刁源，曾志紅

（重慶市農業科學院農產品貯藏與加工研究所，重慶401329）

李屬薔薇科核果類溫帶水果，氣候適應性強，山坡灌叢中或水邊、溝底、路旁等處均可栽培。李已成為重慶第二大主栽水果，栽培面積達82 萬畝，已成為巫山、萬州等地精準扶貧、鄉村振興的重要支柱產業，品種大部為青脆李，具有質脆味甜，風味獨特，營養豐富，促消化、清肝、利水、降壓、導瀉、鎮咳、美容養顏等功效。重慶地區青脆李成熟正值7 月～8 月盛夏，果實生理代謝旺盛，不經處理，采后3 d～5 d 即失去原有質地和風味[1]，迫切需要加工產業鏈支撐。目前李加工多局限于果脯蜜餞，新型加工制品相對較少。隨著人們生活質量和健康水平要求的不斷提高及生活節奏的加快，人們對果蔬的需求正由數量向質量轉變，要求方便、營養、安全的果蔬產品。

果酒加工過程混入的果肉、果渣微粒以及配料中帶入雜質，易在果酒中形成懸浮物使其產生渾濁和沉淀[2]。另外果酒中含有的蛋白質、果膠、鞣質、纖維素、多糖類大分子、單寧和蛋白質的絡合物以及酒石酸鹽等在酒中以膠體狀態存在，使果酒透光率和穩定性變差。渾濁和沉淀都嚴重影響到果酒的外觀，難以被消費者接受。青脆李果酒在加工、貯存過程中易出現沉淀、渾濁、褐變等現象，嚴重影響青脆李果酒品質，本研究通過篩選青脆李果酒適宜發酵菌種、發酵及澄清工藝，目的是為高品質青脆李果酒生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬酸、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸鈉：均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；硅藻土：化學級，上海山浦化工有限公司；殼聚糖：食品級，上海金錦樂實業有限公司；明膠：食品級，青海明膠股份有限公司；果酒酵母RV002、RV171、RV818：安琪酵母股份有限公司。

FA2004A 電子天平：上海精天電子儀器有限公司；HPX-250 電熱恒溫生化培養箱：上海躍進醫療器械廠；PHS-3E 酸度計：上海雷磁儀器有限公司；WZS 手持折光儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；754E 紫光外可見分光光度計：天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

按青脆李原漿質量0.04%比例，分別稱取RV002、RV171 和 RV818 安琪果酒酵母，按質量比 1 ∶10 加入2%糖液中，輕輕攪拌至溶解，40 ℃～42 ℃水浴鍋中保持活化30 min，備用。

1.2.2 加糖量

參照枇杷果酒[3]，根據下列公式計算加糖量。

式中：X 為加糖量，kg；m 為果漿質量，kg；TSS 為青脆李原漿可溶性固形物含量，%；20 為加糖后TSS需達到20%。

1.2.3 酵母發酵特性比較

將破碎制漿后的青脆李原漿可溶性固形物（total soluble solids，TSS）調整至20%，按青脆李原漿質量0.04 %接種活化后的 RV002、RV171 和 RV818，25 ℃發酵，以CO2逸出停止，前后兩天失重差小于0.5 g，表明酵母發酵基本完結，確定為發酵終止時間，比較3 種酵母發酵所得酒液品質指標。

1.2.4 果酒發酵工藝優化

酵母接種量：青脆李原漿加白砂糖調配可溶性固形物至20%，加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的酵母菌，25 ℃保溫發酵；發酵溫度：在適宜接種量的基礎上，分別在 15、20、25、30、35 ℃下保溫發酵；發酵時間：在適宜接種量、溫度的基礎上，分別在10、11、12、13、14 d 下 25 ℃保溫發酵。測定發酵終了 TSS、總酸、酒精度[4]。以酒精度為工藝參數優化考核指標，根據單因素試驗結果，采取L9（33）正交試驗優化發酵溫度、時間及接種量，因素水平表見表1。

表1 正交試驗L9（33）因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 測定方法

總酸：采用葡萄酒、果酒通用分析方法[5]，吸取10.00 mL 果酒（液溫 20 ℃）于 100 mL 燒杯中，加入50 mL 水，插入電極，放入轉子，置于電磁攪拌器上攪拌，用NaOH 標準滴定液滴定至pH=8.2 為其終點，記錄消耗NaOH 標準滴定液體積，同時做空白試驗。

式中：X 為果酒中總酸含量（以酒石酸計），g/L；C為NaOH 標準滴定液的濃度，mol/L；V0為空白試驗消耗NaOH 標準滴定液體積，mL；V1為果酒滴定時消耗NaOH 標準滴定液體積，mL；V2為吸取果酒樣品的體積，mL；75 為酒石酸的摩爾質量，g/mol。

可溶性固形物：參照張巍巍等[6]方法，混勻取樣，采用4 層紗布進行過濾，濾液用手持折光儀進行測定。

酒精含量：參照李國輝等[7]方法，使用容量瓶取100 mL 待測果酒，加入快速測定儀的蒸餾瓶中，使用100 mL 蒸餾水分3 次潤洗容量瓶，將液體一并加入蒸餾瓶中。之后在蒸餾瓶中分別加入3 滴～5 滴消泡劑和氧化鈣乳濁液。選擇酒精蒸餾模式，將取樣時所用的容量瓶懸掛于出液口，設置餾出液重量，開始蒸餾。3 min～4 min 后蒸餾完成。使用蒸餾水將餾出液定容至刻度，待測；依照儀器操作程序，設備校正后，將待測蒸餾液直接加入測定儀中，待儀器穩定后示數即為酒精度測定值（單位%vol）。

1.2.6 澄清劑制備

稱取20 g 明膠，用9 倍去離子水加熱溶解，配制成20%明膠溶液，冷卻備用；準確稱取10 g 硅藻土，加90 mL 水浸泡24h，至完全成糊狀或溶解，配制成10%的硅藻土溶液，備用；稱取2.00 g 殼聚糖，加入2%乙酸的溶液50 mL，攪拌直完全溶解備用；稱取2.00 g 殼聚糖，加入50 mL 沸水，攪拌直完全溶解備用。

1.2.7 澄清處理

取1 000 mL 李子果酒原酒于磨口玻璃瓶中，加入不同濃度梯度的澄清劑溶液（硅藻土、明膠、殼聚糖，硅藻土用量 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L；明膠用量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L；殼聚糖用量 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L，充分振蕩混勻后靜置 48 h，取上清液測定透光率和色度，考察澄清劑類型及用量對青脆李果酒澄清效果的影響。

1.2.8 青脆李果酒透光率和色度的測定

參照羅軍杰等[8]方法，以蒸餾水為空白對照，用分光光度計在680 nm 下用1 cm 比色皿測定澄清后酒液的透光率，在530 nm 下測定吸光度（色度）。

1.2.9 數據處理

試驗數據采用excel2010 軟件處理，試驗數據以平均值±標準偏差（x±s）形式表示。

2 結果與分析

2.1 不同酵母菌種對青脆李果酒發酵特性的影響

不同菌種發酵特性比較見圖1。

圖1 不同酵母菌種發酵特性比較分析Fig.1 The fermentation results of different yeast

圖1 結果顯示，RV002、RV171 和 RV818 發酵處理酒精度在10%vol 以上，其中RV818 達到10.9 %vol，RV818 總酸含量相對較低，而可溶性固形物相差不大，RV818 可作為優勢菌種進一步篩選適宜接種量、發酵溫度和時間。

2.2 優選菌種RV818接種量、發酵溫度、發酵時間對青脆李果酒發酵品質的影響及發酵工藝參數優化

2.2.1 接種量對青脆李果酒發酵品質的影響

接種量對青脆李果酒發酵品質的影響見表2。

接種量對青脆李發酵果酒品質的影響結果顯示隨接種量增加，TSS 略降；總酸先降后增；酒精度先增后降，峰值接種量0.04%，當接種量＞0.04%時，酒精度快速下降，可能由于酵母繁殖代謝過旺，本身耗大量糖分，致使營養物質消耗增加并生成較多代謝產物，使菌體細胞環境惡化，過早衰老并發生自溶[4]。綜合考慮接種量0.04%作為后續正交優化試驗。

表2 接種量對青脆李果酒發酵品質的影響Table 2 The influence of inoculation quantity on fermentation characteristics of Prunus americana wine

2.2.2 發酵溫度對青脆李果酒發酵品質的影響

發酵溫度對青脆李果酒發酵品質的影響見表3。

表3 發酵溫度對青脆李果酒發酵品質的影響Table 3 The influence of fermentation temperature on fermentation characteristics of Prunus americana wine

發酵溫度對青脆李果酒發酵品質的影響結果顯示隨發酵溫度升高，TSS 波動變化；總酸先降后增，峰值發酵溫度為25 ℃；發酵溫度25 ℃時酒精度最高；當溫度＞30 ℃后，酒精度下降，表明適當溫度下酵母菌對糖分利用率高，酒精度高，這與報道的主發酵溫度是影響果酒風味的主要因素吻合[9-10]，綜合考慮發酵溫度選擇25 ℃作為后續正交優化試驗。

2.2.3 發酵時間對青脆李果酒發酵品質的影響

發酵時間對青脆李果酒發酵品質的影響見表4。

表4 發酵時間對青脆李果酒發酵品質的影響Table 4 The influence of fermentation temperature on fermentation characteristics of Prunus americana wine

發酵時間對青脆李果酒發酵品質的影響結果顯示隨發酵時間延長，TSS 逐漸下降，總酸逐漸下降，酒精度逐漸上升，到一定程度后，增長緩慢。考慮成本因素選擇12 d 作為后續正交優化試驗。

2.2.4 青脆李果酒發酵工藝參數優化

正交試驗結果見表5。

表5 L9（33）正交試驗結果分析表Table 5 The results of the orthogonal experiment about fermentation condition

由正交試驗結果R 值可以看出，各因素對青脆李果酒酒精度的影響順序為C（接種量）＞B（溫度）＞A（時間）。從各因素K 值可以看出，時間、溫度、接種量3 個因素試驗最佳組合為A2B2C3，即發酵時間12 d、發酵溫度25 ℃，接種量0.05%，即正交試驗第5 組。采取A2B2C3驗證試驗檢測發現青脆李果酒酒精度達到10.92%vol，證明可行。

2.3 不同澄清劑對青脆李果酒的澄清效果比較

2.3.1 硅藻土對青脆李果酒的澄清效果

硅藻土主要成分為SiO2，是一種比表面積很大，具有很強吸附能力的多孔結構物質[11]，其含有的少量鈣、鎂離子能與果膠作用，形成果膠酸鹽，還能吸附少量色素、酵母等其他懸浮物[12]。硅藻土澄清效果見圖2。

由圖2 可知，硅藻土溶液對青脆李果酒澄清效果有一定作用，隨著添加量的增加，透光率（A680nm）有一定程度的上升，色度（A530nm）逐漸下降，至加入量為0.4 g/L 時透光率達81.2%，較對照提高了4.68 倍；色度為0.132，較對照低89.27%，硅藻土用量超過0.4 g/L時透光率增加和色度變化趨勢不明顯。

2.3.2 明膠對青脆李果酒的澄清效果

明膠屬于蛋白質類，可以和果酒中的單寧物質結合形成蛋白質-單寧絡合物，隨著絡合物的逐漸增多，將會吸附酒中的懸浮物聚沉，從而達到澄清效果。明膠澄清效果見圖3。

圖2 硅藻土澄清效果Fig.2 Effect of diatomite content on clarification

圖3 明膠澄清效果Fig.3 Effect of glutin content on clarification

圖3 結果表明，明膠對青脆李果酒澄清效果不太明顯，說明青脆李果酒中原來含有的單寧、色素等多酚類物質相對較少。明膠加入量為0.6 g/L 時透光率達44.1 %，較對照提高1.87 倍；色度為0.539，較對照低56.18%，隨著明膠用量的增加，透光率降低，色度增加。

2.3.3 殼聚糖不同溶解方法對青脆李果酒的澄清效果

殼聚糖屬于天然的陽離子型絮凝劑，可以吸引帶負電荷的蛋白質、單寧和果膠纏繞殼聚糖線性分子結構上形成絮狀沉淀物，從而達到澄清的目的[13]。殼聚糖澄清效果見圖4 和圖5。

由圖4 可知，殼聚糖（酸溶解）對青脆李果酒澄清效果明顯。隨著殼聚糖用量增加，透光率大幅度升高，殼聚糖用量為3.0g/L 時透光率達到96.8%，較對照提高5.77 倍；色度為0.046，較對照低96.26%，若繼續增加殼聚糖用量，造成果酒透光率下降，色度增加，酒體渾濁。考慮到殼聚糖（酸溶解）用于澄清對酒體易造成不良影響，探索沸水溶解殼聚糖用于澄清酒體發現：由圖5 可知，殼聚糖（沸水溶解）其達到最大透光率的適宜添加量仍為3.0 g/L，透光率93.0%，色度0.069，但較酸溶解下降3.93%，色度上升33.33%，雖然澄清效果也較為理想，但不如酸溶解的澄清效果。

圖4 殼聚糖（酸溶解）澄清效果Fig.4 Effect of chitosan（acid dissolution）on clarification

圖5 殼聚糖（沸水溶解）澄清效果Fig.5 Effect of chitosan（boiling water dissolution）on clarification

3 結論

比較3 種酵母對青脆李果酒發酵特性的影響，確定菌種RV818 作為青脆李果酒發酵適宜菌種。通過發酵接種量、發酵溫度、發酵時間單因素及正交試驗，得到青脆李果酒發酵最佳工藝條件為：酵母接種量0.05%，發酵溫度25 ℃、發酵時間12 d，此時酒精度達10.92%vol。

通過比較硅藻土、明膠、不同溶解方法殼聚糖對青脆李果酒澄清透光率和色度的影響發現：3 種澄清劑均具有一定效果，但以酸溶解殼聚糖澄清效果最佳，沸水溶解效果較次，綜合考慮采用沸水溶解殼聚糖作為青脆李果酒澄清首選方式，可減少酸溶解殼聚糖澄清造成的青脆李果酒品質下降和適口性差問題。