槐角多糖抗氧化活性研究

王杰，劉瑞珍，劉東超，李慧，劉忠華，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；2.煙臺(tái)市森林資源監(jiān)測保護(hù)服務(wù)中心，山東煙臺(tái)264013）

槐角是一種傳統(tǒng)中藥材，以其為原料制成的槐角茶有軟化血管、疏風(fēng)熱、抑菌消炎、潤腸通便之效，尤其對(duì)降三高有極好療效，受到廣大老年人的歡迎。槐角藥理功能源于其中的活性物質(zhì)組分，如黃酮、異黃酮以及三萜皂苷等[1-3]，隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展，更多活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，其主要成分多糖也受到研究關(guān)注[4]，方艷夕等[5]研究發(fā)現(xiàn)槐角多糖中主要單糖成分為葡萄糖、果糖；槐角果皮多糖和種子多糖有吸濕保濕的作用，對(duì)自由基有一定清除作用[6]。但目前對(duì)槐角多糖抗氧化活性研究相對(duì)較少，本文以提取的槐角多糖為試驗(yàn)材料，采用自由基評(píng)定法對(duì)ABTS+自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH 自由基進(jìn)行了抗氧化活性研究，以期為槐角多糖的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

槐角：河北國安藥材批發(fā)市場，產(chǎn)自河北國安地區(qū)。挑選顏色均勻、形態(tài)飽滿、果莢完好、無病蟲害的槐角，自然晾干，60 ℃烘干 2 h，粉碎、過 20 目篩，干燥存儲(chǔ)。

1.1.2 試劑

果膠酶（40 U/mg）、纖維素酶（100 U/mg）、EDAE-52 纖維素柱料、ABTS、DPPH、過硫酸鉀（K2S2O8）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、FeSO4、水楊酸、30%H2O2試劑、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、苯酚、濃硫酸、無水乙醇：北京化工廠；pUC18 質(zhì)粒（Takera）、DNA Marker（DL5000）、6×Loading Buffer、Golden View 核酸染料：北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（ML104/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機(jī)（CT15RT）：美國Sigma公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD-80）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1100）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Infinite）：瑞士 Tecan 集團(tuán)；電泳儀（Power Pac）、紫外熒光凝膠成像儀（Chemi Doc XRS+）：美國BIO-RAD。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 槐角多糖提取及分離純化

1.3.1.1 槐角多糖提取

參照李彩霞等[6]方法，采用超聲輔助復(fù)合酶解法水提槐角多糖，準(zhǔn)確稱取5.00 g 槐角粉加入100 mL 蒸餾水，200 W 超聲處理20 min 后加入0.05 %混合酶（果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比 1 ∶1），50 ℃水浴 60 min，沸水浴滅酶5 min，6 000 r/min 離心10 min，清液減壓濃縮，加3 倍95%乙醇過夜，離心，沉淀加水復(fù)溶，加入1/4 體積的Sevage 試劑[7]（三氯甲烷與正丁醇體積比4 ∶1），重復(fù) 3～4 次，上清液醇沉過夜，沉淀于-80 ℃預(yù)冷12 h，再轉(zhuǎn)至-80 ℃真空冷凍干燥得到槐角多糖（sophorae fructus polysaccharides，SFP）。

1.3.1.2 槐角多糖純化

將槐角多糖（SFP）用中性去離子水配成100 mg/mL的多糖溶液，取10 mL 離心，上清液緩慢加入DEAE-52 纖維素層析柱，待SFP 全部進(jìn)入柱料后，向?qū)游鲋屑訚M去離子水，流速為1.0 mL/min，8 mL 每管。分別用 0、0.1、0.3、0.7 mol/L 的 NaCl 溶液線性梯度洗脫。將蒸餾水洗脫組分合并、濃縮、真空冷凍干燥，得槐角次級(jí)多糖SFP-1；將NaCl 溶液洗脫的酸性多糖合并、透析、再濃縮后真空冷凍干燥，得到槐角次級(jí)多糖SFP-2[8]。

1.3.2 槐角多糖溶液配制

精確稱量0.64 g 槐角多糖SFP 及純化分離后的SFP-1、SFP-2，配制成6.40 mg/mL 的多糖母液，按二倍稀釋法稀釋成 3.20、1.60、0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL的樣品溶液，4 ℃存放。

1.3.3 槐角多糖抗氧化試驗(yàn)

1.3.3.1 槐角多糖清除ABTS+自由基試驗(yàn)

參照 Yang 等[9]方法修改，ABTS（7.4 mmol/L）與K2S2O8（2.6 mmol/L）等體積混合，4 ℃遮光12 h，用前稀釋至734 nm 吸光值為0.700±0.020。準(zhǔn)確吸取樣品和ABTS 試劑各2 mL，暗反應(yīng)6 min，立即于734 nm 測吸光值，記為Ai；以等量蒸餾水替代樣品，記為A0；2 mL樣品與2 mL 的95%乙醇混勻，同樣反應(yīng)時(shí)間和波長下測吸光值，記為A1。

式中：Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值；A1為對(duì)照組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.3.3.2 槐角多糖清除DPPH 自由基試驗(yàn)

參照 Gong 等[10]方法，精確配制 0.15 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品與DPPH 溶液各2 mL混勻，暗反應(yīng) 30 min，517 nm 測吸光值，記為 Ai；蒸餾水替代樣品與2 mL 的DPPH 溶液反應(yīng)，同樣操作，記為A0；2 mL 的95%乙醇與2 mL 樣品混合反應(yīng)，吸光值記為A1。

式中：Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值；A1為對(duì)照組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.3.3.3 槐角多糖清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)

采用鄰苯三酚自氧化法，向反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的樣品溶液 SFP、SFP-1、SFP-2 各 1 mL，4.5 mL Tris-HCl[50 mmol/L pH（8.1±0.1）]和 3.2 mL 蒸餾水，37 ℃水浴 20 min 后加入 0.3 mL 鄰苯三酚（5 mmol/L），于325 nm 處每隔30 s 記錄一次數(shù)值（以10 mmol/L 的HCl 調(diào)零），測 5 min，計(jì)算反應(yīng)速度斜率 ΔAi；對(duì)照組以蒸餾水代替樣品測吸光值變化斜率，記為ΔA0。

式中：ΔAi為樣品吸光值變化的斜率；ΔA0為對(duì)照組吸光值變化的斜率。

1.3.3.4 槐角多糖清除羥基自由基試驗(yàn)

參照Chen 等[11]方法調(diào)整，配置6 mmol/L 的硫酸亞鐵、6 mmol/L 水楊酸-乙醇試劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光存放。在10 mL 離心管中加入2 mL FeSO4溶液、樣品和H2O2（0.3%）各 2 mL，渦旋混勻，室溫（25 ℃）放置 10 min，加入 2 mL 水楊酸-乙醇試劑，37 ℃水浴 30 min，510 nm測吸光值記為Ai；以蒸餾水代替樣品反應(yīng)，記為A1；樣品2 mL、蒸餾水4 mL 與2 mL 水楊酸-乙醇試劑混合反應(yīng)，記為A0。

式中：Ai為樣品試驗(yàn)組吸光值；A1為對(duì)照組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.3.3.5 槐角多糖抑制DNA 損傷試驗(yàn)

采用 Fenton 反應(yīng)體系[12]，取 200 μL 離心管冰浴操作，加入 1 μL 硫酸亞鐵溶液 （6 mmol/L）、2 μL 的pUC18 質(zhì)粒 DNA（0.5 mg/mL）和 5 μL 的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.2）渦旋混勻，加入 2 μL 樣品/對(duì)照，2 μL 的 H2O2（0.3%），37 ℃水浴孵育 30 min，與 2 μL的6×Loading Buffer 混勻。將凝膠板置于電泳儀中，上樣10 μL，150 V 電泳30 min，紫外熒光凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用 Excle 2016、SPSS 19.0 和 Origin 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用平均值和方差表示顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除作用

ABTS+自由基是ABTS 氧化后產(chǎn)生的，在734 nm處有高吸收峰，呈穩(wěn)定藍(lán)綠色，與抗氧化物結(jié)合后會(huì)出現(xiàn)褪色的現(xiàn)象，故可用于測定抗氧化物質(zhì)的作用效果[13]。槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除活性見圖1。

圖1 槐角多糖對(duì)ABTS+自由基清除活性Fig.1 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on ABTS+free radical

如圖1 可知，樣品與ABTS+自由基清除率成量效關(guān)系，在最高試驗(yàn)濃度（6.40 mg/mL）時(shí)，槐角多糖樣品SFP、SFP-1、SFP-2 和對(duì)照品 VC的 ABTS+自由基清除率分別是99.73 %、97.54 %、98.36 %、99.81 %。樣品SFP-1 和SFP-2 濃度低于3.20 mg/mL 時(shí)清除率隨樣品濃度升高變化速率快，高于3.20 mg/mL 之后趨于平緩；SFP 在濃度 0.05 mg/mL～0.80 mg/mL 時(shí)，清除率隨樣品濃度升高變化速率較快，在濃度高于0.80 mg/mL后，上升趨于平穩(wěn)。

2.2 槐角多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

槐角多糖對(duì)DPPH 清除作用如圖2 所示。

圖2 3 種槐角多糖對(duì)DPPH 自由基清除活性Fig.2 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on DPPH free radical

多糖濃度與DPPH 自由基的清除率成正相關(guān)。當(dāng)濃度為 6.4 mg/mL 時(shí)，槐角多糖 SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)DPPH 自由基平均清除率可達(dá)到64.94 %、87.05 %、86.65%。槐角多糖SFP 在濃度0.05 mg/mL 到3.20 mg/mL之間時(shí)，隨濃度提高清除率上升迅速，在3.2 mg/mL 到6.4 mg/mL 之間時(shí)趨于平穩(wěn)；槐角多糖純化分離的次級(jí)多糖SFP-1 和SFP-2 作用效果相似，隨濃度升高清除率出現(xiàn)交叉：在低濃度0.05 mg/mL～0.10 mg/mL時(shí)SFP-2 對(duì)DPPH 自由基清除率高于SFP-1，濃度在0.20 mg/mL～0.80 mg/mL 時(shí) SFP-1 對(duì) DPPH 自由基清除率高于SFP-2，在濃度為0.80 mg/mL 時(shí)二者對(duì)DPPH 自由基清除能力相同，之后隨濃度SFP-1 的清除率高于SFP-2，在6.4 mg/mL 時(shí)清除率接近相似。

整體來看純化分離后的多糖SFP-1 和SFP-2 清除率高于槐角多糖SFP，推測可能與各組分中單糖組成、分子量、糖苷鍵、糖醛酸含量有關(guān)。此外，槐角多糖對(duì)ABTS 自由基和DPPH 自由基抑制作用基本一致，但對(duì)ABTS 自由基清除能力略高，其原因可能與自由基性質(zhì)有關(guān)，ABTS 自由基更適合親水性抗氧化劑測評(píng)[14-15]。

2.3 槐角多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

超氧自由基是一種活性氧，可與其他分子反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基、單線態(tài)氧等物質(zhì)，對(duì)機(jī)體造成直接和間接損傷。槐角多糖對(duì)超氧自由基清除活性見圖3。

圖3 3 種槐角多糖對(duì)超氧自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on superoxide radical

如圖3 槐角多糖樣品與對(duì)照品對(duì)超氧自由基清除能力呈量效關(guān)系，但VC的清除能力優(yōu)于測試多糖樣品溶液，在試驗(yàn)最高濃度（6.40 mg/mL）時(shí)對(duì)照品VC和槐角多糖SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)超氧自由基清除率分別是 100.00 %、18.15 %、50.92 %、31.08 %。槐角多糖SFP-1 對(duì)超氧自由基清除能力優(yōu)于SFP 和SFP-2，在濃度0.40 mg/mL～3.20 mg/mL 之間時(shí)對(duì)超氧自由基抑制能力隨濃度升高變化快，超過3.20 mg/mL 后作用效果趨于平緩。

綜合來看，槐角多糖SFP、SFP-1 和SFP-2 對(duì)超氧自由基清除率表現(xiàn)出SFP-1＞SFP-2＞SFP，多糖的超氧自由基清除能力可能與O-H 鍵電離能力有關(guān)，糖鏈上連接的羧基、醛基越多，O-H 鍵越難電離，清除超氧陰離子能力越強(qiáng)。SFP-1 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力較高，因而推斷SFP-1 可能含有較多的醛酸基團(tuán)[16]。

2.4 槐角多糖對(duì)羥基自由基清除作用

羥基自由基是機(jī)體中最為活躍的自由基，可對(duì)細(xì)胞造成直接損傷，是評(píng)價(jià)抗氧化的重要指標(biāo)。槐角多糖對(duì)OH-·的清除作用如圖4 所示。

圖4 槐角多糖對(duì)羥基自由基清除活性Fig.4 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on hydroxyl radical

在試驗(yàn)最高濃度 6.4 mg/mL 時(shí)，VC和樣品SFP、SFP-1、SFP-2 對(duì)羥基自由基清除能力分別是98.68%、95.64%、87.49%、93.95%，VC溶液平均清除率均高于槐角多糖溶液。在較低濃度0.05 mg/mL～0.40 mg/mL 時(shí)SFP-2 對(duì)羥基自由基清除能力高于SFP-1，之后隨濃度升高SFP-2 清除能力略低于SFP-1，但在3.20 mg/mL～6.40 mg/mL 之間時(shí)再次超過SFP-1。對(duì)比槐角多糖SFP 與SFP-1 可知，當(dāng)溶液濃度低于1.6 mg/mL 時(shí)SFP對(duì)羥基自由基清除率高于SFP-1，但濃度在3.20 mg/mL時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，SFP 對(duì)羥基自由基的清除率低于SFP-1，并在實(shí)驗(yàn)最高濃度6.4 mg/mL 時(shí)再次高于SFP-1 的作用效果。清除OH-·能力與多糖中羥基數(shù)量、氨基基團(tuán)有關(guān)，推測槐角多糖的糖鏈中含有較高的羥基含量，與單糖組成有關(guān)[17]。

2.5 槐角多糖抑制DNA損傷作用

羥基自由基可直接造成DNA 損傷，采用Fenton反應(yīng)測定槐角多糖對(duì)由羥基自由基造成DNA 損傷的抑制作用[18]，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 槐角多糖抑制羥基自由基造成的DNA 損傷電泳圖Fig.5 DNA damage electrophoresis of SFP and SFP-1 inhibiting hydroxyl radicals

對(duì)照組、試驗(yàn)組與空白組DNA 電泳條帶，均有不同程度的開環(huán)和開鏈現(xiàn)象；而與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組均表現(xiàn)出抑制DNA 損傷作用，樣品SFP 和SFP-1 隨濃度升高抑制DNA 損傷效果越明顯，在濃度3.2 mg/mL時(shí)，SFP 的開鏈結(jié)構(gòu)含量高于SFP-1，即SFP 抑制DNA損傷能力低于SFP-1，在濃度6.4 mg/mL 時(shí)，SFP 的開鏈結(jié)構(gòu)含量低于SFP-1，即SFP 抑制DNA 損傷作用高于SFP-1。

3 結(jié)論

槐角多糖通過自由基評(píng)價(jià)法對(duì)各組分抗氧化活性研究表明，雖然試驗(yàn)樣品溶液與對(duì)照品VC溶液相比抗氧化能力略低，但3 種純化分離的槐角多糖SFP、SFP-1 及SFP-2 均表現(xiàn)出較好的抗氧化作用。在試驗(yàn)最高濃度6.4 mg/mL 時(shí)，槐角多糖SFP 對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基清除能力分別為99.73 %、64.94 %、18.15 %及95.64 %；槐角次級(jí)多糖SFP-1 對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除率可達(dá)到97.54%、87.05%、50.92%及87.49%；槐角次級(jí)多糖SFP-2 對(duì)4 種自由基清除率依次為98.36%、86.65%、31.08%及93.95%。在羥基自由基抗氧化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，槐角多糖SFP 和SFP-1 對(duì)DNA 損傷的抑制作用結(jié)果顯示，槐角多糖對(duì)羥基自由基造成的DNA 開鏈、開環(huán)有保護(hù)作用。研究說明槐角多糖具有較好的抗氧化能力，其在生物制藥、保健食品、化妝品等方向具有一定的開發(fā)潛力[19-20]。