氧化鋯基微量元素共摻雜羥基磷灰石增韌涂層研究

代釗, 王銘, 王雙, 李靜, 陳翔, 汪大林, 祝迎春

氧化鋯基微量元素共摻雜羥基磷灰石增韌涂層研究

代釗1, 王銘2, 王雙1, 李靜1, 陳翔1, 汪大林1, 祝迎春2

(1. 上海第二軍醫大學附屬長海醫院, 上海 200433; 2. 中國科學院 上海硅酸鹽研究所, 中國科學院特種無機涂層重點實驗室, 上海 200050)

氧化鋯陶瓷具有良好的力學性能和生物相容性, 是一種應用前景廣闊的硬組織植入體材料。為促進植入體與骨組織形成穩定的骨結合, 本研究利用等離子噴涂制備了氧化鋯增韌的鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石(ZrO2-DHA)涂層, 對涂層物相、形貌以及力學性能和體外生物學性能進行了研究。結果表明, 鍶、硅、氟的共摻雜通過成骨分化的信號轉導通路提高了羥基磷灰石涂層對成骨細胞的黏附和分化等生物學性能; 不同復合組分的ZrO2-DHA涂層均不同程度地促進了小鼠成骨前體細胞的細胞活力和成骨分化相關基因的表達。在細胞培養的第7 d, DHA含量為70%的ZrO2-DHA涂層(7DHA)和的相對表達量分別是對照組的約2.8倍和2.3倍; ZrO2-DHA涂層的力學性能隨氧化鋯組分的增加而增強, DHA涂層和7DHA涂層的硬度和結合強度分別為250.8、313 HV和25.1、31.8 MPa; 7DHA涂層中的交織網絡結構, 對殘余熱應力、壓應力和拉伸力的承受能力較DHA涂層明顯提升, 滿足植入體應用需求。

鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石; 等離子噴涂; 氧化鋯增韌; 力學性能; 成骨

近年來, 氧化鋯(Zirconia, ZrO2)陶瓷作為硬組織植入物受到了持續關注, 在口腔植入體方面的應用逐漸增加。氧化鋯陶瓷具有優異的斷裂韌性、彈性模量[1-3], 能夠耐受長期負荷, 其生物相容性也早已得到證實[4-5]。此外, 氧化鋯還能夠滿足患者日益提高的美學要求, 避免鈦金屬引起的潛在健康危害, 如植入體周圍炎癥、過敏反應等[6-8]。然而氧化鋯屬于生物惰性陶瓷, 在其表面制備生物活性涂層是促進植入體早期骨整合的有效方法。

羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)作為植入體涂層材料已有多年臨床應用, 是一種與人體骨磷灰石結構類似的人工合成鈣磷陶瓷材料。而天然羥基磷灰石含有除鈣磷以外其他多種微量元素, 微量元素摻雜的羥基磷灰石(DHA)與人體骨磷灰石結構更接近, 且已被證明具有更優越的生物活性和更少的植入物炎癥反應[9], 前期進行的微量元素摻雜羥基磷灰石研究印證了上述觀點[10-14]。然而, 磷灰石的高度脆性使其在頻繁承載負荷后發生過早的磨損和斷裂, 影響性能發揮的持久性。引入力學性能優良的增韌材料制備復合涂層, 是目前改進這一缺陷的有效方法[15-17]。

目前已上市的氧化鋯植入體幾乎均未使用涂層[18], 且尚未見氧化鋯植入體上制備羥基磷灰石涂層相關研究。本研究將鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石(DHA)與氧化鋯按不同比例復合, 通過等離子噴涂法在氧化鋯基體上制備氧化鋯增韌的鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石(ZrO2-DHA)復合涂層, 并對涂層的力學性能和體外生物學性能進行了研究。

1 實驗方法

1.1 試劑和材料

氧化鋯基材10 mm×2 mm和25.4 mm×2.5 mm、氧化鋯粉體分別購自蘇州阿洛泰和江蘇立達公司, 分析級Ca(H2PO4)2·H2O、Ca(OH)2、SrO、SiO2、CaF2和生物級4-硝基苯磷酸二鈉(PNPP)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自上海阿拉丁公司。小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1購自中科院細胞庫, α-MEM培養基、青–鏈雙抗購自賽默飛世爾, 胎牛血清購自杭州四季青,-甘油磷酸鈉(-GP)、抗壞血酸(AA)購自西格瑪奧德里奇, 茜素紅S染色液購自北京索萊寶。

1.2 實驗方法

1.2.1 涂層的制備

以Ca(OH)2和Ca(H2PO4)2?H2O為原料, 以SrO、SiO2和CaF2為微量元素引入劑, 水熱法合成HA和DHA。三種元素的摻雜量按照既往研究[12]投料, 使其在DHA中的質量分數與天然骨磷灰石保持一 致[19-21]。采用噴霧造粒法制備熱噴涂粉, 其中, DHA和ZrO2分別按照質量比為7 : 3、5 : 5、3 : 7復合造粒。氧化鋯基材經噴砂增加表面粗糙度, 然后使用大氣等離子噴涂設備(Dualumsch. Wasser, Sulzer Metco, Switzerland)按照表1中噴涂參數制備HA/DHA涂層和質量比分別為7 : 3、5 : 5、3 : 7的ZrO2-DHA涂層(分別記為7DHA、5DHA、3DHA)。將得到的涂層樣品在650 ℃晶化處理2 h, 備用。

1.2.2 表征和力學性能

X射線衍射儀(UltimaⅣ, Rigaku, Japan)和傅里葉變換紅外光譜儀(IRAffinity-1, Shimadzu, Japan)檢測樣品相組成。掃描電鏡(s-4800, Hitachi, Japan)和光學顯微鏡觀察涂層表面和截面形貌。力學性能實驗設7DHA、5DHA、3DHA涂層實驗組和DHA涂層對照組。維氏硬度計(HMV-G21DT, Shimadzu, Japan)和萬能試驗機(UTM 5592-F2-G2, Instron, USA)檢測涂層硬度和結合強度: 硬度檢測隨機選擇涂層表面10個點測硬度值, 萬能試驗機檢測每組5個樣品的涂層結合強度, 結果用(ˉ±s)表示。

1.2.3 體外生物學性能檢測

(1) 實驗分組、細胞培養和涂層浸提液制備

體外生物學性能實驗增加空白對照組、ZrO2基材組和陽性對照組(HA涂層)。小鼠成骨前體細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養, 每2 d換液一次, 確保生長狀態良好。參照國家標準GBT16886.12-2017[22],制備涂層浸提液。

表1 噴涂參數

(2) 細胞活力實驗和毒性評級

涂層樣品滅菌后置于24孔板, MC3T3-E1以4× 104Cells/well接種, 細胞貼壁后更換低血清培養基(含0.5%胎牛血清的基礎培養基)孵育24 h, 避光加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT母液, 細胞繼續培養4 h后吸出孔內液體, 加入500 μL DMSO充分溶解結晶, 吸取300 μL紫色液體至96孔板, 酶標儀(Multiskan FC, Thermo Fisher)檢測490 nm的吸光度。通過計算細胞相對增值率(Relative Growth Rate, RGR)來評價涂層細胞毒性, 即RGR=(涂層組吸光度值/基材對照組吸光度值)×100%。若RGR≥100%, 則細胞毒性為0級。

(3) 細胞黏附實驗

相同方法接種多孔板, 在接種1、6和12 h后吸去培養液, 加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min, PBS沖洗2次, 避光加入300 μL DAPI熒光染液, 倒置熒光顯微鏡(TH4-200, Olympus, Japan)下觀察, 每個樣品隨機選取5個不同視野拍照并計數細胞, 細胞數用(ˉ±s)表示。

(4) 堿性磷酸酶活性實驗

相同方法接種多孔板, 細胞貼壁后更換成骨誘導分化培養基, 每2 d換液一次, 于第1、7 d終止培養, 加入0.2%曲拉通200 μL裂解細胞, 收集細胞裂解液離心, 吸取上清液50 μL至96孔板, 加入100 μL濃度為1 mg/mL的PNPP工作液, 細胞培養條件繼續孵育30 min后用酶標儀檢測405 nm吸光度ODALP。BCA蛋白試劑盒檢測各孔總蛋白量(mg), ODALP/總蛋白值用(ˉ±s)表示。

(5) 成骨分化相關基因表達實驗

相同方法接種多孔板, 細胞貼壁后更換誘導分化培養液, 每2 d換液一次, 于第1、7 d終止培養, 加入1 mL Trizol抽提細胞總RNA, 反轉錄合成cDNA, 熒光定量PCR儀(Step one plus, ABI, USA)擴增成骨分化相關基因、和內參基因(引物序列見表2), 得到Ct值, 使用ΔCt法計算各組各基因的相對表達量。

表2 引物序列

(6) 成骨礦化染色實驗

相同方法接種多孔板, 細胞貼壁后更換涂層浸提液, 每2 d換液一次, 于第14 d終止培養,每孔加入4%多聚甲醛500 μL固定15 min, PBS清洗2次后加入茜素紅S染色液200 μL避光染色15 min, PBS清洗至清洗液無色, 于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 數據處理

所得數據及圖像用Jade6.5、OMNIC32、Microsoft Excel和Origin2018軟件處理、作圖。2組之間比較用t檢驗,<0.05為具有顯著性。

2 實驗結果

2.1 粉體和涂層結構表征

圖1(a)可見經噴砂處理后, 氧化鋯基材呈現出不規則粗糙表面, 該表面有利于噴涂粉體與基材之間形成穩固的結合。圖1(b)可見高溫熔融的液滴狀顆粒堆積而成的涂層表面, DHA粉體熔融狀態良好, 呈現等離子噴涂涂層表面形貌特征。圖中可見涂層微裂紋, 有助于釋放涂層內應力, 防止涂層剝落, 提高結合強度。涂層的粗糙表面有利于細胞的黏附、生長。

圖2(a~c)分別為7DHA涂層表面拋光后的SEM照片及Ca (綠色)、Zr (藍色)元素分布的SEM照片, 深灰色區域(A)為含Ca的DHA, 灰白色區域(B)為ZrO2。圖2(d~f)和圖2(g~i)分別是DHA、7DHA、3DHA涂層的平面和截面照片, 可見DHA和ZrO2在涂層的三維結構中呈現相互交錯和包繞狀態。

圖3(a)是HA和DHA粉體的XRD圖譜, 符合羥基磷灰石標準譜(JCPDS No.09-0432), 表明本實驗合成了羥基磷灰石材料; 插圖為2=30°~35°的局部放大, 可見DHA峰位出現了右移, 說明元素的引入使DHA發生了晶格畸變。圖3(b)為兩者的FT-IR圖譜, 圖中可見羥基磷灰石的PO43–v4 (569、604 cm–1)、PO43–v3 (962、1042、1092 cm–1)和OH–(631 cm–1)的振動峰, 以及719 cm–1處的OH?F鍵振動峰。圖3(c)是三種組分ZrO2-DHA涂層的XRD圖譜, 三者具有相似的衍射峰相, 氧化鋯特征峰隨其含量增加而增強。圖3(d)是放大的7DHA涂層的XRD圖譜, 可見明顯的羥基磷灰石和氧化鋯衍射峰, 未見其他雜質峰相。

圖1 氧化鋯基材(a)和DHA涂層表面(b)的SEM照片

圖2 7DHA涂層的SEM照片(a)和元素分布掃描照片(Ca(b)和Zr(c)); 涂層平面(d~f)和截面(g~i)的SEM照片: DHA(d, g)、7DHA (e, h)、3DHA (f, i)

圖3 HA和DHA粉體的XRD圖譜(a)及FT-IR譜圖 (b), DHA涂層的XRD圖譜(c)及7DHA涂層的放大XRD圖譜(d)

2.2 涂層力學性能

圖4(a)可見, 涂層硬度和結合強度隨氧化鋯含量的增加而增大, 其中, DHA涂層的硬度和結合強度分別達到(250.8±18.9) HV和(25.1±2.6) MPa, 3DHA涂層的硬度和結合強度達到(526.2±23.6) HV和(46.2± 4.3) MPa。不同涂層組的硬度值和結合強度值之間的差異具有統計學意義。圖4(b)為5DHA涂層的拉伸斷面照片, 圖中可見, 涂層拉伸斷面出現在基材–涂層界面、涂層內部及涂層–膠水界面, 表明ZrO2-DHA涂層的拉伸斷裂屬于混合型失效模式。

2.3 涂層體外生物學性能

2.3.1 涂層對細胞活力的影響

圖5表示經過24 h低血清培養后各組樣品對MC3T3-E1細胞活力的影響。DHA組、7DHA組、HA組和氧化鋯基材組的OD值分別為(0.46±0.02)、(0.44±0.02)、(0.39±0.01)和(0.37±0.01), 各組差異存在統計學意義, 表明DHA涂層和7DHA涂層組與HA涂層和氧化鋯基材組相比, 具有較高的細胞活力。相對于氧化鋯基材, 各種DHA含量涂層的RGR均大于100%, DHA涂層的最大值達到125.3%, 提示各涂層的細胞毒性評級均為0級。

圖4 涂層顯微硬度、結合強度(a)以及拉伸斷面照片(b)

圖5 細胞活力實驗OD值

2.3.2 涂層對細胞黏附的影響

圖6(a~f)是各組樣品在細胞接種后第6 h的細胞黏附照片, 藍色斑點為熒光染液著色的細胞核。圖6(g)是各組樣品在三個時間點細胞黏附數量柱狀圖。在第6 h, HA組、DHA組和7DHA組的細胞粘附數量分別為29.40、41.60和39.20, 后兩組明顯高于前者, 差異具有統計學意義; 但5DHA組和3DHA組的細胞黏附數量分別為30.20、29.00, 與HA組相比未見明顯差異。在第1和12 h可見相同的趨勢。DHA涂層和7DHA涂層與HA涂層相比促進了成骨細胞的黏附, 而隨著ZrO2含量的增加, 促進作用逐漸減弱。

2.3.3 涂層對細胞成骨細胞分化的影響

圖7(a~f)是培養14 d的MC3T3-E1茜素紅S染色照片, 可見DHA組礦化最明顯, 其次為7DHA組, 兩組結果均優于其他各組。圖7(g)是MC3T3-E1培養1、7 d后的堿性磷酸酶活性柱狀圖。可見隨培養時間的延長, ALP活性逐漸增強; 在第7 d, DHA組和7DHA組的ALP活性分別達到(0.96±0.02)和(0.89± 0.01) OD/mg, 明顯高于HA組的(0.82±0.01) OD/mg, 差異具有統計學意義。礦化染色實驗和ALP活性實驗提示, DHA涂層和7DHA涂層促進成骨分化能力優于HA涂層。

圖6 細胞黏附實驗的熒光照片(a~f)和細胞黏附數量(g)

圖7 MC3T3-E1細胞茜素紅染色照片(a~f)和ALP活性比較(g)

2.3.4 涂層對細胞成骨分化相關基因表達的影響

成骨分化相關基因和的相對表達見圖8。圖8(a)可見, 在細胞培養的第1 d, 各組表達幾乎未見差別。在細胞培養的第7 d, DHA組和7DHA組的相對表達量分別達到3.35和2.84, 明顯高于HA組的2.51, 差異具有統計學意義。圖8(b)中,的表達情況與出現相同的趨勢, 提示與HA涂層相比, DHA涂層和7DHA組可促進成骨細胞早期表達成骨功能基因。

圖8 成骨相關基因表達隨時間變化圖

(a)expression; (b)expression (*<0.05)

3 討論

體外生物學實驗表明, DHA涂層的促成骨性能優于HA涂層和ZrO2基材, 三種微量元素的引入是涂層促成骨性能提升的主要因素。鍶是鈣的同族元素, 取代HA中鈣(1)后可使晶格尺寸增加、晶格穩定性下降[23], 從而提高溶解度[24]; 硅元素取代PO43–, 使HA產生晶格缺陷和更多的負電表面[25]; 氟元素引入HA后造成Ca(2)空位, 引起晶格缺陷[14]。本研究合成的DHA的XRD圖譜中, 特征峰位發生了右移, 提示元素成功引入羥基磷灰石晶格中, 并導致了晶格結構改變。因微量元素引入造成的晶格缺陷提高了DHA在體液環境中的溶解度, 釋出的Sr2+擁有刺激成骨細胞分泌新生骨組織基質, 抑制破骨細胞活性、減少骨吸收的雙重調節功能[26-29], Si元素和F–則促進成骨細胞增殖和分化[14,30-32]。體外生物學性能的研究結果表明, 本研究所制備的DHA涂層在促成骨性能提高方面具有多元素協同作用[12], 相比于HA涂層表現出明顯的優勢。

成骨分化相關基因的表達數據, 從機制角度佐證了上述促成骨性能實驗的結果。和是成骨分化標志性功能蛋白, 兩者在早期成骨細胞分化、骨組織基質形成等方面發揮了重要作用。在細胞培養第7 d, DHA涂層的和表達量是ZrO2基材的3~4倍, 明顯高于HA涂層。鍶元素可引起以Runt相關轉錄因子()以及/信號通路中的關鍵分子-連環蛋白()和卷曲8 ()的上調[33-34], 而該信號通路在骨骼發育及骨穩態中發揮核心作用。Honda等[31]證明微量硅摻雜HA可上調成骨分化相關基因、、、和表達, Sun等[10]進一步檢測了微量硅摻雜HA對多達20余種成骨分化信號通路相關基因的表達, 發現、、、和的高表達。Li等[30]則證明微量氟摻雜HA可上調、、和的表達, Wang的研究[14]進一步表明微量氟摻雜HA可增加和的表達。ZrO2-DHA涂層含有鍶、硅、氟三種微量元素, 三種元素通過不同的分子生物學機制提高了ZrO2-DHA涂層的成骨活性。

ZrO2-DHA涂層的促成骨性能與涂層中DHA的含量呈正相關, DHA的含量越多, 涂層生物學性能越好。MTT實驗結果表明, DHA涂層和ZrO2-DHA涂層對MC3T3-E1毒性評級為0; 而與ZrO2基材相比, DHA涂層和ZrO2-DHA涂層在不同程度上增強了細胞活力。促成骨分化實驗證實, DHA涂層和ZrO2-DHA涂層的早期促成骨性能明顯優于ZrO2基材。這些結果顯示ZrO2-DHA作為涂層材料在植入體促成骨性能方面具有明顯優勢。

ZrO2-DHA涂層力學性能與ZrO2含量呈正相關, ZrO2含量越多, 涂層力學性能越好。力學性能的提升來自ZrO2的增韌作用, 最先沉積在氧化鋯基材表面的ZrO2熔融液滴, 與氧化鋯基材的結合力較DHA更強。DHA和ZrO2粉體在密度、粒徑等方面存在差異, 熔融狀態不完全一致, 在氧化鋯基材上沉積時相互交織、包繞和穿插, 形成三維網狀結構。這種結構使ZrO2-DHA涂層對殘余熱應力、壓應力和拉伸力的承受能力較DHA涂層明顯提升, 對植入體涂層在硬組織內發揮長期作用具有重要意義。

ZrO2-DHA涂層的生物活性雖有所減弱, 但7DHA涂層的早期促成骨活性仍優于HA涂層。結合生物學性能方面的優勢, 7DHA涂層在早期促成骨性和對植入體受到硬組織機械力的抗性均優于HA涂層, 是一種理想的生物活性涂層材料。

4 結論

本研究通過等離子噴涂法在氧化鋯基材上制備了鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石涂層和氧化鋯增韌鍶、硅、氟微量摻雜羥基磷灰石涂層, 為氧化鋯植入體的表面改性提供了新的依據。通過涂層的力學性能和體外生物學性能的研究得到以下結論:

1) DHA涂層在體外的早期促成骨性能優于HA涂層和ZrO2基材。

2) ZrO2-DHA涂層的促成骨性能明顯優于ZrO2基材, 這是由涂層中的DHA組分決定的。ZrO2-DHA復合涂層的促成骨性能與DHA含量呈正相關。

3) ZrO2-DHA涂層的力學性能明顯優于DHA涂層, 涂層中ZrO2與DHA復合形成三維結構。ZrO2-DHA涂層的力學性能與ZrO2含量呈正相關。

4) 相對于HA涂層, 7DHA涂層在體外促成骨性能和力學性能方面具有明顯的優勢。在氧化鋯植入體表面制備DHA和ZrO2比例為7 : 3的涂層, 是一種具有應用前景的硬組織植入材料。

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Zirconia Reinforced Trace Element Co-doped Hydroxyapatite Coating

DAI Zhao1, WANG Ming2, WANG Shuang1, LI Jing1, CHEN Xiang1, WANG Da-Lin1, ZHU Ying-Chun2

(1. Hospital of Changhai, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2. Key Laboratory of Inorganic Coating Materials, Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050, China)

Zirconia is a kind of prospective hard tissue implant materials, which possesses superior mechanical properties and excellent biocompatibilities. To promote the stable osseointegration between Zirconia implants and tissue, zirconia-toughened trace Sr-, Si- and F- co-doped hydroxyapatite (ZrO2-DHA) was coated by plasma spraying on zirconia. The phase composition and structure of coatings were characterized, and the mechanical properties andbiological properties were investigated. The results show that co-doping of trace Sr, Si and F enhances the biological properties of coatings on adhesion and differentiation of osteoblasts through the signal transduction pathway of osteogenic differentiation. All of ZrO2-DHA coatings promote the cell viability and gene expression in osteogenic differentiation of MC3T3-E1. On the 7th day of cell culture, the relative expression levels ofandin the ZrO2-DHA coating containing 70% DHA (7DHA) were about 2.8 times and 2.3 times higher than those in the ZrO2substrate group, respectively. Mechanical properties of ZrO2-DHA coatings are improved with the increment of zirconia ratio. Hardness of DHA coating and 7DHA coating are 250.8 and 313 HV respectively and their bond strength are 25.1 and 31.8 MPa, respectively. 7DHA coatings with network structure possess both excellent mechanical and biological performance for the implant coating application.

Sr/Si/F trace-doped hydroxyapatite; plasma spraying; zirconia reinforcing; mechanical property; osteogenesis

TQ174

A

1000-324X(2020)02-0179-08

10.15541/jim20190053

2019-01-27;

2019-04-02

國家自然科學基金(51232007) National Natural Science Foundation of China (51232007)

代釗(1989–), 男, 碩士研究生. E-mail: zhaodai313@126.com

DAI Zhao (1989–), male, Master candidate. E-mail: zhaodai313@126.com

汪大林, 教授. E-mail: wang_dento@163.com; 祝迎春, 研究員. E-mail: yzhu@mail.sic.ac.cn

WAN Da-Lin, professor. E-mail: wang_dento@163.com; ZHU Ying-Chun, professor. E-mail: yzhu@mail.sic.ac.cn