草魚Rac1基因編碼區(qū)生物信息學(xué)分析

張苗爽，董詩(shī)琳，姜 雪，劉麗霞，張 麗

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

關(guān)鍵字：草魚；Rac1；編碼區(qū)；生物信息學(xué)

Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）是Rho小GTP結(jié)合蛋白家族的成員之一，在細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[1]。Rac小GTP蛋白亞家族中包含了Rac1、Rac2以及Rac3三個(gè)成員，此三種成員間表現(xiàn)出80%以上的高度同源性。其中Rac1主要參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力調(diào)控、細(xì)胞骨架重組、基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞黏附等一系列的細(xì)胞活動(dòng)[2,3]。由于Rac1對(duì)人體細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞增殖凋亡具有調(diào)節(jié)作用，故Rac1基因?qū)ξ赴⒎伟┖徒Y(jié)直腸癌等多種腫瘤的形成起著重要的影響[4]。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Rac1在水生動(dòng)物中的分子研究?jī)H見于斑馬魚(GenBank accession no. BC071548.1)[5]、大菱鲆(GenBank accession no. FJ361904.1)[6]及大黃魚(GenBank accession no. XM_010729684)[7]中。

本研究主要使用生物信息學(xué)的研究方法，從分子水平對(duì)草魚的Rac1基因序列結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物信息學(xué)特性進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，探討草魚Rac1基因的功能信息、遺傳特性及相關(guān)的生理作用機(jī)制，為草魚的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

從GenBank中查找得到草魚Rac1基因的全長(zhǎng)及編碼區(qū)序列（GenBank no.KR809443.1）信息，對(duì)草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)特性及功能結(jié)構(gòu)域的分析與預(yù)測(cè)參照張麗等[8]文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚Rac1基因開放閱讀框（ORF）和編碼蛋白質(zhì)理化特性預(yù)測(cè)與分析

開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）的識(shí)別是研究一個(gè)新的DNA序列是特定蛋白質(zhì)編碼基因的一部分或者全部分的先決條件[9]。可使用Bioedit及Lasergene7.1軟件預(yù)測(cè)草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)理化特性。結(jié)果表明草魚Rac1基因開放閱讀框片段長(zhǎng)度為579 bp，編碼了192個(gè)氨基酸，對(duì)20種常用氨基酸進(jìn)行比對(duì)，得出結(jié)果為亮氨酸(Leu)占其中比例最多，在整個(gè)氨基酸組成中占比9.9%，而組氨酸(His)和色氨酸(Trp)最少，占比均為1.0%。利用蛋白質(zhì)理化性質(zhì)在線分析軟件Rac1編碼的蛋白質(zhì)得出負(fù)氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為21，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為27，分子量為21 465.12 KDa，不穩(wěn)定指數(shù)為33.16，沒有超過(guò)其比對(duì)值40，即編碼產(chǎn)物穩(wěn)定，且其理論等電點(diǎn)值為8.9，半衰期為30 h。

2.2 草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性的預(yù)測(cè)分析

預(yù)測(cè)草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性需運(yùn)用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序，結(jié)果顯示的縱坐標(biāo)正值表示疏水，負(fù)值表示親水，該蛋白質(zhì)第81位半胱氨酸(Cys)疏水性最強(qiáng)(+3.089)，第184位的精氨酸(Arg)親水性最強(qiáng)(-2.622)。整個(gè)編碼產(chǎn)物中，親水氨基酸占53.35%，疏水氨基酸占46.65%，平均分值為+0.117，是正值，疏水，因此可推斷草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)是一種不溶性的蛋白質(zhì)。

2.3 草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)糖基化是指糖在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過(guò)程，蛋白質(zhì)糖基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有著重要意義，同時(shí)糖鏈結(jié)構(gòu)的不同還會(huì)影響蛋白質(zhì)的半衰期和降解[8]。利用在線分析軟件對(duì)Rac1編碼蛋白質(zhì)的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)中只有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)是Asn39。

2.4 草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向形成的周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，這些構(gòu)象通過(guò)各種次級(jí)鍵共同構(gòu)成其三級(jí)結(jié)構(gòu)。草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋(Hh) 占 39.58%，無(wú)規(guī)則卷曲( Cc)占34.38%，β-轉(zhuǎn)角( Tt)占6.77%，β-折疊( Ee)占19.27%，由此判斷出草魚RAC1基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型。

3 討論

Rho小GTP蛋白家族包括七個(gè)亞家族，Rac是其中之一。Rac小GTP蛋白亞家族中包括Rac1、Rac2以及Rac3。Rac1能刺激細(xì)胞周期和DNA的合成，并參與Ras介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。Rac1具有調(diào)控細(xì)胞骨架及細(xì)胞防御機(jī)制的能力，能在病原菌入侵的時(shí)候發(fā)揮重要作用，主要包括吞噬作用產(chǎn)生的活性氧和抗微生物肽[10]。據(jù)報(bào)道，有關(guān)Rac1基因在分子方面的研究多見于人類和嚙齒等動(dòng)物，草魚Rac1基因的分子功能方面的研究還是一片空白。經(jīng)分析，草魚Rac1基因的開放閱讀框?yàn)?79 bp，分子質(zhì)量為21.46512kDa，根據(jù)其理論等電點(diǎn)為8.9，不穩(wěn)定指數(shù)為33.16，小于40，推斷該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。在20種氨基酸的組成中，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的亮氨酸（Leu）數(shù)量最多（19個(gè)），弱堿性的組氨酸（His）數(shù)量最少（2個(gè)），對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)起重要作用的半胱氨酸（Cys）有7個(gè)，終止α-螺旋的脯氨酸（Pro）有14個(gè)。

據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，草魚Rac1基因編碼的蛋白質(zhì)為192個(gè)氨基酸經(jīng)螺旋折疊而成的穩(wěn)定不溶性蛋白質(zhì)，存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)可能會(huì)影響蛋白質(zhì)對(duì)絲氨酸蛋白水解酶的鈍化或抑制的作用。草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示二級(jí)結(jié)構(gòu)中Hh、Ee、Cc、Tt所占的比例分別為39.58%、19.27%、34.38%、6.77%，故草魚Rac1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主的混合型蛋白。

在病原菌入侵時(shí)，由于Rac1能發(fā)揮重要作用，且調(diào)控部分細(xì)胞防御機(jī)制，可以預(yù)防魚類疾病，為人類提供優(yōu)質(zhì)的魚類產(chǎn)品，降低養(yǎng)殖損失，因此在漁業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。本文通過(guò)對(duì)草魚Rac1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能的預(yù)測(cè)，能夠更好地為草魚的抗病育種供理論參考。