藻類基因編輯技術研究進展

何婕培

（中國海洋大學魚山校區 山東青島 266000）

基因編輯技術是一種對基因組中特定DNA 片段進行堿基的添加、刪除或替換的技術。核酸內切酶和特定的蛋白在基因編輯中起重要作用，其中核酸內切酶廣泛應用于DNA 的定點切割，可識別和剪切特定的DNA 序列；特定的蛋白，例如鋅指蛋白可識別和結合特定的DNA 序列，Cas9 蛋白可結合和切割特定的DNA 序列。當定點切割靶序列完成后，細胞固有的非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）修復過程與這些融合蛋白聯手，就能導致基因組定點插入、刪除或移碼突變，引起外源DNA 插入、基因功能缺失等［1］。

近年來，隨著高通量測序技術的高速發展，已有多種海洋藻類完成了基因組測序，褐藻中的海帶（Saccharina japonica）和長囊水云（Ectocarpussiliculosus），綠藻中的萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和團藻（Volvox carteri），硅藻中的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和灰胞藻（Cyanophora paradoxa）等［2-4］，為海洋藻類學研究提供了豐富的遺傳基因資源。然而海洋藻類，特別是大型海藻，普遍存在生長周期長、遺傳轉化方法不成熟、各種分子生物學研究在藻類中起步晚的特點，這為基因編輯技術在藻類中的開展帶來了難度。而CRISPR／Cas9 技術作為目前熱門且簡單的基因編輯技術，2013年就首次成功應用于植物的基因組編輯中［1］。CRISPR／Cas9 基因編輯技術逐步成熟，目前CRISPR／Cas9 基因編輯技術作為較為簡單方便的基因編輯方法，已應用于多種植物，包括擬南芥、水稻、煙草、大豆、玉米、高粱等植物中［5］。

圖1 Cas9 蛋白示意圖

圖2 CRISPR／Cas9 流程圖

1 CRISPR／Cas9 技術在微藻中的應用

2014年，Jiang 等［6］首次將CRISPR／Cas9 技術應用于藻類中，構建Cas9 和gRNA 載體轉化至萊茵衣藻中，培養24 h 后觀察到基因的瞬時表達，但沒有得到穩定遺傳的突變株。Nymark 等［7］利用三角褐指藻內源的葉綠素a／c 結合蛋白基因（LHCF2）和U6 啟動子分別調控Cas9 與gRNA 的轉錄，實現了對葉綠體信號識別因子54（CPSRP54）的定點突變，得到了穩定遺傳的轉化株，并利用高分辨率溶解曲線的方法進行突變結果的檢測，這是該方法首次應用于藻類的基因編輯研究。Shan 等［8］在微擬球藻（Nannochloropsis）中對硝酸還原酶基因進行了定點突變，得到的突變株在含有NH4Cl 的培養基中能正常生長，但是NaNO3對其有致死作用。該研究組進一步改進了檢測方法，比較了基因組DNA 是否經過酶切對轉化效率的影響，以及PCR 的產物直接進行高通量測序可驗證堿基突變的發生。

表1 CRISPR／Cas9 技術在藻類中的應用

2 CRISPR／Cas9 系統在大型海藻中應用存在問題

2.1 成熟的遺傳轉化方法 植物常用的轉入外源基因的方法包括基因槍法、農桿菌轉化法、PEG介導轉化法、電穿孔法等。微藻中使用的轉化方法較為成熟，其中電穿孔法為常用的轉化方法，已能成熟運用并實現穩定遺傳［9］。成熟的遺傳轉化方法，對于外源基因導入受體細胞，起到至關重要的作用。同時，對于提高受體細胞的轉化率，提高成功轉化的細胞成活率也很重要。可以說，成熟的遺傳轉化體系是CRISPR／Cas9 技術在大型藻類中成功運用的基礎。

2.2 富集成功轉化的細胞 成功將外源基因導入藻類細胞后，常用抗生素的方法篩選成功轉化的細胞，其中潮霉素和氯霉素用于篩選條斑紫菜葉狀體的遺傳轉化研究，常見的篩選抗生素還包括氨芐、除草劑等［9］。在CRISPR／Cas9 基因編輯系統，轉入CRISPR／Cas9 表達載體后，可同時得到成功突變的和未發生突變的個體；區別得到并富集突變個體至關重要，直接影響到后期的檢測結果與突變個體的后續培養。

3 CRISPR／Cas9 技術已有研究對大型海藻中的指導意義

CRISPR／Cas9 技術在微藻中有成功運用的實例［6］，其在海洋大型藻類的運用也具有理論可行性。研究表明，通過對外源基因的密碼子優化和使用內源性強啟動子可提高外源表達載體在海藻中的表達效率，由于藻類基因組中通常有較高的GC含量，因此在密碼子的偏好性上更傾向于使用G和C［10］。現已有研究對大型藻類中的指導意義如下，主要從3 個方面進行改進：轉入載體的優化、遺傳轉化方法的選擇和編輯效率的提高。

3.1 載體的優化

3.1.1 Cas9 序列優化 相關研究人員已經證實，Cas9 基因密碼子是否進行優化，在高等植物中的編輯效率不同。Nymark 等［7］通過優化Cas9 的密碼子，并采用藻體內源的啟動子啟動Cas9 和sgRNA的轉錄，顯著提高了CRISPR／Cas9 系統在三角褐指藻中的基因編輯效率，使得基因編輯效率達31%，同時通過在1 個靶基因上運用2 個sgRNA，基因編輯效率提高至25%～63%。研究表明，人類細胞和水稻的密碼子偏好性對Cas9 基因進行優化后，用于編輯水稻基因組中的同一位點，雖然都獲得了能穩定遺傳的轉化株，但編輯效率不同：根據水稻基因組優化的Cas9 基因突變效率明顯高于根據人類細胞優化的Cas9 基因的突變效率。在玉米的原生質體基因編輯實驗中，也得到了與水稻中相同的實驗結果［11］。通過以上論述，為了使該系統在大型海藻中更高效地發揮作用，需要根據相應物種的核心基因集的密碼子偏好性對其進行基因優化，連入CRISPR／Cas9 表達載體中。

3.1.2 啟動子的選擇 通常情況下，細胞中RNA聚合酶Ⅱ類啟動子主要介導編碼蛋白質基因的表達，不能調控非編碼RNA 的轉錄。在已知的高等植物和動物的細胞核中，RNA 聚合酶Ⅲ類啟動子會識別并轉錄非編碼RNA。所以在構建載體的過程中，常用該類啟動子進行gRNA 的轉錄。此外，改造后的Ⅱ類啟動子也可進行小RNA 的轉錄。至目前為止，應用于植物中進行gRNA 轉錄的主要是內源性RNA 聚合酶Ⅲ類啟動子，例如擬南芥U6 啟動子、水稻U6 啟動子、水稻U3 啟動子及水稻tRNA 啟動子等［4，12］，也有使用CAMV35s 啟動子成功轉錄gRNA 的研究［6］。2014年，Jiang 等［6］利用擬南芥的U6 啟動子轉錄gRNA 后，在萊茵衣藻中得到成功的表達。研究表明，雖然外源的啟動子也有功能，但是選取目標物種的內源啟動子，對該項技術在其中的運用非常重要。

3.2 遺傳轉化方法的選擇

3.2.1 基因槍轉化 研究表明，基因槍的轉化率較低，并且在各物種中的變化范圍較大，轉化率通常在10-3～10-2之間。條斑紫菜質體遺傳轉化體系的建立，優化了基因槍轟擊參數，當真空度為28 mmHg，轟擊距離為6 cm，氦氣壓力是1 350 psi時，轉化效率最高，約為4.2‰［9］。目前基因槍介導的外源基因轉化方法，在海洋大藻中運用較普遍，并且經過轉化后，能得到穩定表達個體。

3.2.2 其他轉化方法 關于大型外源基因的轉化方法，采用了多種方法。其中包括證明了PEG轉化法和農桿菌轉化法在紫菜原生質中應用的可行性，以及電擊轉化法在紫菜原生質中的應用，但這些轉化方法都具有一定的局限性，有待進一步優化和改進。嘗試多種轉化方法，并得到一套成熟的遺傳轉化體系，對于基因編輯技術的成功運用，編輯效率的提高，都有重要意義。

3.3 編輯效率的提高 據文獻報道，所有成功轉入載體的個體不可能全部發生基因編輯，預計只有30%～40%的成功轉化株會發生突變：生物介導的轉化方法會導致Cas9 基因序列的斷裂和不完全 融合［13］。然 而Cas9 序列 和sgRNA 序列的 完 整性是基因突變發生的必要條件，與農桿菌轉化突變率在20%～90%相比［13］，當采用生物技術的轟擊轉入外源基因時，基因槍轉化的突變率更低，在5%～12%之間［14］。所以，通過Cas9 序列的優化、內源啟動子的運用、轉化方法的選擇，這些步驟都能在一定程度上提高CRISPR／Cas9 系統在大型海藻體內的編輯效率。

4 展望

CRISPR／Cas9 技術運用廣泛，幾乎可在所有的模式生物中實現基因的定點敲除和編輯，涵蓋人類體外培養細胞、斑馬魚、小鼠、大鼠、果蠅、秀麗隱桿線蟲、水稻、擬南芥、煙草等多種物種［5，12］。在海洋生物中也已有多種生物成功運用該技術，其中包括玻璃海鞘、海膽、海葵、大西洋角螺、海七鰓鰻、大西洋鮭、端足類動物、脊尾白蝦、三角褐指藻的種類較為廣泛，涵蓋了尾索動物、棘皮動物、刺胞動物、貝類、圓口綱、魚類、甲殼動物和藻類等生物類群［15］。

大型海藻作為重要的自然資源，其可食用、可作飼料、工業原料和有機肥料，是具有較高價值的商品。許多海區大規模養殖大型海藻，這就對大型海藻的良種選育提出了更高的要求，而CRISPR／Cas9 基因編輯的運用對其精確育種有著重要的實踐意義。隨著大型海藻基因組測序工作的進一步進行，在海洋大藻中迫切需要建立簡單高效的基因編輯系統，用于研究其基因功能。目前CRISPR／Cas9沒有在大型海藻中的運用實例，包括褐藻的代表物種海帶、紅藻的代表物種紫菜等。與其他模式物種相比，在藻類中的運用起步較晚，還有一些技術問題有待解決，但CRISPR／Cas9 基因編輯技術與其他基因編輯技術相比，擁有無可比擬的優勢和運用前景，是研究基因功能的強大工具。