超導量點—免疫熒光法快速測定糧食中黃曲霉毒素B1的方法驗證

胡元斌 許艷霞 王達能 馬 志 倪小英 唐顏蘋 余 楊

(1. 湖南省糧油產品質量監測中心，湖南 長沙 410201；2. 深圳賽泰諾科技股份有限公司，廣東 深圳 518000)

黃曲霉毒素B1是已知的化學物質中致癌性最強的一種，主要誘發肝癌，對人和動物均具有極強的危害性。食物黃曲霉毒素B1污染比較常見，花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品都極易受到污染，且以南方高溫、高濕地區受污染最為嚴重[1]。

黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有儀器檢測法[2-5]和免疫學檢測法[6-8]。儀器檢測法有高效液相色譜法、同位素稀釋液相色譜—串聯質譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法，其中高效液相色譜法是目前實驗室應用最廣泛的方法[9-10]。儀器檢測法特異性強、準確度高，但對操作人員技術要求高，前處理繁瑣，難以實現大批量樣品檢測，且無法滿足及時高效的市場監管需求。免疫學檢測法主要是利用抗原抗體的特異性免疫反應對樣品中的抗原或抗體進行定量、定性或定位檢測，屬于快速檢測方法，與儀器檢測法相比，該方法具有設備小巧、檢測速度快、成本低等優點，在市場監管中具有廣泛的應用，且適合大批量樣品的檢測。

根據標記物的不同，黃曲霉毒素B1免疫學檢測法有酶聯免疫法[11]、膠體金法[12]、時間分辨熒光法、熒光微球法、量子點法[13]等。量子點是一種準零維的納米材料，具有激發光譜寬，發射光譜窄，熒光壽命長，斯托克位移大，熒光強度大，且可通過粒徑控制熒光波長及強度等特點，是一種理想的熒光標記物，在生物成像、免疫檢測等領域廣泛應用[14]。

研究擬以超導量子點為熒光標記物，利用超導量點優越的熒光性能，結合免疫熒光技術，建立一種靈敏、準確的糧食黃曲霉毒素B1的快速檢測方法，并對該方法的準確性、重復性和臺間差等參數進行驗證，旨在考察該方法在糧食黃曲霉毒素B1的快速檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1快速定量檢測卡：深圳市賽泰諾生物技術有限公司；

ST稀釋液：深圳市賽泰諾生物技術有限公司；

黃曲霉毒素B1酶聯免疫檢測試劑盒：北京華安麥科生物技術有限公司；

黃曲霉毒素B1免疫親和柱：北京中檢維康生物技術有限公司；

甲醇：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

色譜柱：RBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，美國Agilent公司；

糙米、玉米樣品：湖南家潤多超市。

1.1.2 儀器

免疫熒光快速定量檢測系統：QD-Infinity型，深圳市賽泰諾生物技術有限公司；

酶標儀：rayto RT-6000型，深圳雷杜生命科學股份有限公司；

液相色譜儀：Agilent 1100型，安捷倫科技有限公司。

1.2 樣品檢測

1.2.1 樣品預處理 稻谷樣品脫殼后粉碎至全部過20目篩，小麥和玉米直接粉碎至全部過20目篩，稱取過篩樣品5 g置容器中(如50 mL離心管)，加入60%甲醇溶液25 mL，混勻，置搖床震蕩10 min，選擇4 000×g離心5 min，取上清液備用。

1.2.2 超導量點—免疫熒光法快速法 取經預處理的樣品上清液100 μL與ST緩沖液500 μL震蕩混勻，得待檢液1，取75 μL待檢液1垂直緩慢滴入檢測卡的加樣孔，孵育15 min后，選擇“快速檢測”模式，當出現請插入檢測卡提示時，立即將檢測卡插入QD-Infinity快速免疫熒光分析儀，儀器自動根據檢測卡上的二維碼讀取產品信息并進行檢測，13 s儀器顯示檢測結果，檢測完畢。

1.2.3 酶聯免疫法 取經預處理的樣品上清液，按照AFB1酶聯免疫檢測試劑盒的檢測方法進行測試。

1.2.4 高效液相色譜法

(1) 上樣液制備：取經預處理的樣品上層清液10 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋于50 mL離心管中，渦旋混勻，再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液。

(2) 凈化：免疫親和柱平衡后，將柱上面連接25 mL一次性注射器，準確移取15 mL上樣液，調節開關，使液體以1～2 d/s的速度流出；待液體排干后，用去離子水洗滌2次，每次10 mL；待液體排干后，上樣1 mL甲醇，流速1 d/s，收集洗脫液，用水稀釋定量至2 mL，最后用0.22 μm 微孔濾器過濾后轉移至樣品瓶采用柱后光化學衍生高效液相色譜法測量。

(3) 色譜條件：選擇ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相A為水，B為甲醇，C為乙腈；等度洗脫(58% A+20% B+22% C)；流速1.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積100 μL；激發波長360 nm；發射波長440 nm；柱后光化學衍生器。

1.3 數據處理

所有數據均采用Excel 2010和SPSS 22.0處理。

2 結果與討論

2.1 準確性

2.1.1 與酶聯免疫法比較 酶聯免疫法是當前應用較多的黃曲霉毒素B1的快速檢測方法，也是國標(GB 5009.22—2016第四法)規定方法。隨機選取43份不同黃曲霉毒素B1的樣品，分別采用超導量點—免疫熒光法快速法和酶聯免疫法測定，將兩種測定方法的結果進行配對t檢驗、相關分析和方差分析，見表1。

由表1可知，43份樣品的超導量點—免疫熒光法快速法和酶聯免疫法檢測結果平均值分別為10.84，11.47 μg/kg，兩種方法配對檢驗t值為1.002，而在95%的置信度下，t分布的雙邊臨界t值為2.326，因此，兩種方法的檢測結果之間無顯著性差異。

分別采用偏相關和距離分析分析了超導量點—免疫熒光法快速法和酶聯免疫法相關性(見表2)，偏相關結果表明，兩種方法檢測結果間的Pearson相關系數為0.965，表明兩種方法在0.01水平(雙側)上顯著相關。距離分析結果也表明兩種方法的Pearson相關系數為0.965，表明兩種方法的結果為相似矩陣。

表1 超導量點—免疫熒光法快速法與酶聯免疫法t檢驗表Table 1 The t-test results of QD-Infinity and ELISA

表2 超導量點—免疫熒光法快速法與酶聯免疫法偏相關分析?Table 2 The partial correlation analysis of QD-Infinity and ELISA (n=43)

? **. 在0.01水平(雙側)上顯著相關。

對超導量點—免疫熒光法快速法和酶聯免疫法的檢測結果之間進行了線性相關擬合，結果表明，兩種方法檢測結果線性相關系數R2=0.930 6，線性方程斜率為0.906，與1接近。說明超導量點—免疫熒光法快速法和酶聯免疫法的檢測結果非常接近，無顯著性差異。

假定方差齊性，采用S-N-K(s)比較方法，比較了兩種檢測方法結果之間的差異，結果見表3。結果表明，兩組結果的F值為0.003，顯著性為0.957，遠大于0.05，表明兩組結果無顯著性差異。

2.1.2 與高效液相色譜法比較 高效液相色譜法是黃曲霉毒素B1檢測的經典方法。隨機選取25份不同黃曲霉毒素B1的樣品，分別采用超導量點—免疫熒光法快速法和高效液相色譜法測定，將兩種測定方法的結果進行配對t檢驗、相關分析和方差分析，見表4。

圖1 超導量點—免疫熒光法快速法與酶聯免疫法相關性Figure 1 The correlation of QD-Infinity and ELISA

表3 超導量點—免疫熒光法快速法與酶聯免疫法方差分析Table 3 The variance analysis of QD-Infinity and ELISA

表4 超導量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法t檢驗表Table 4 The t-test results of QD-Infinity and HPLC

由表4可知，25份樣品的超導量點—免疫熒光法快速法和高效液相色譜法檢測結果平均值分別為272.91，283.90 μg/kg，兩種方法配對檢驗t值為0.849，而在95%的置信度下，t分布的雙邊臨界t值為2.391，因此，兩種方法的檢測結果之間無顯著性差異。

分別采用偏相關和距離分析分析了超導量點—免疫熒光法快速法和高效液相色譜法相關性(見表5)，偏相關結果表明，兩種方法檢測結果間的Pearson相關系數為0.990，表明兩種方法在0.01水平(雙側)上顯著相關。距離分析結果也表明兩種方法的Pearson相關系數為0.990，表明兩種方法的結果為相似矩陣。

對超導量點—免疫熒光法快速法和酶聯免疫法的檢測結果之間進行了線性相關擬合，結果表明，兩種方法檢測結果線性相關系數R2=0.980 8，線性方程斜率為1.089 9，與1接近，說明兩種方法的檢測結果非常接近，無顯著性差異。

假定方差齊性，采用S-N-K(s)比較方法，比較了超導量點免疫熒光法和高效液相色譜法兩種檢測方法結果之間的差異，結果見表6。結果表明，兩組結果的F值為0.010，顯著性為0.920，遠大于0.05，表明兩組結果無顯著性差異。

表5 超導量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法偏相關分析?Table 5 The partial correlation analysis of QD-Infinity and HPLC (n=25)

? **. 在0.01水平(雙側)上顯著相關。

2.2 重復性

隨機選取1個樣品，采用超導量點—免疫熒光法重復測定6次，結果分別為7.10，7.33，7.44，6.59，6.69，6.36 μg/kg，平均值為6.92 μg/kg，相對標準偏差為6.29%(低于10%)，表明該方法具有較好的重復性。

圖2 超導量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法相關性Figure 2 The correlation of QD-Infinity and HPLC

表6 超導量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法方差分析Table 6 The variance analysis of QD-Infinity and HPLC

2.3 穩定性

隨機選取3個不同濃度梯度(編號為a、b、c，對應濃度分別為3.72，23.31，9.95 μg/kg)的樣品，采用超導量點—免疫熒光法快速法，每份樣品分別孵育15，16，18，20 min 后，進行測定，考察孵育時間對檢測結果的影響，結果見圖3。由圖3可看出，隨著孵育時間的增長，測定結果逐漸升高。與15 min相比，a、b、c 3個樣品孵育20 min 后，檢測結果分別升高15.9%，17.8%，18.9%。

2.4 臺間差

在隨機兩臺QD-Infinity免疫熒光快速定量檢測系統上對3個不同濃度梯度的樣品(樣品編號分別為1、2、3，濃度分別為5.1，20.4，37.1 μg/kg)進行檢測，每個樣本平行檢測6次，測定結果采用配對t檢驗來比較2臺儀器間是否存在顯著性差異，經計算t=0.393，t0.025,17=2.458，t

圖3 超導量點—免疫熒光法孵育時間的影響Figure 3 The influence of time for the results of QD-Infinity

表7 超導量點—免疫熒光法臺間差結果Table 7 The differents equipments QD-Infinity

3 結論

超導量點—免疫熒光法是一種以超導量子點為熒光探針的免疫分析方法，具有靈敏、準確、快速等優點。通過與高效液相色譜法及酶聯免疫吸附法比較，該方法測定糧食中的黃曲霉毒素B1具有較高的準確性和符合國標(GB 5009.22—2016)要求的精密度，任意兩臺儀器間的檢測解結果也無顯著性差異。該方法檢測結果與孵育時間密切相關，隨著孵育時間的延長，檢測結果逐漸上升，因此，在使用過程中應嚴格控制孵育時間。超導量點—免疫熒光法測定糧食中黃曲霉毒素B1準確、高效，具有較高的應用前景。