高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

劉延波 張世凱 趙志軍 王 賢 潘春梅

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院〔酒業(yè)學(xué)院〕，河南 鄭州 450046；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046； 3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046； 4. 賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300； 5. 河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733)

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的歷史，其獨(dú)特的釀造工藝和特殊香味成分，在世界酒類產(chǎn)品中別有風(fēng)味[1]。中國(guó)酒曲源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，有學(xué)者[2]認(rèn)為，制曲釀酒可與中國(guó)古代四大發(fā)明相媲美。釀酒微生物和酶的載體是大曲[3]，大曲內(nèi)部微生物種類錯(cuò)綜復(fù)雜，主要包括三大類即霉菌、細(xì)菌和酵母菌[4]，淀粉酶(主要可以分為α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化型淀粉酶3種)、蛋白酶、纖維素酶和酯化酶等都是大曲中與釀酒有關(guān)的酶系[5]，另外酶可以將大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成可以被微生物所利用的小分子物質(zhì)，如氨基酸脫氫酶將氨基酸轉(zhuǎn)化為氨，然后3-羥基丁酮和氨通過縮合作用合成四甲基吡嗪[6]，直接參與獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)形成；由此可見釀酒的出酒率和成品酒的質(zhì)量與大曲酶系密不可分[4]。

在白酒釀造過程中，提高產(chǎn)淀粉酶菌株的作用可以提高淀粉原料的利用率和出酒率[7]。淀粉酶降解原料所產(chǎn)生的小分子糖類物質(zhì)不僅是釀酒過程中各種微生物生長(zhǎng)繁殖所需的碳源，而且小分子物質(zhì)之間也會(huì)發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)從而生成多種風(fēng)味成分[8]。近年來，與白酒大曲微生物相關(guān)的研究逐漸增多，主要是對(duì)白酒大曲中微生物的品種、數(shù)目及其與白酒大曲理化性質(zhì)關(guān)系的研究[9]，以及對(duì)白酒大曲中優(yōu)良菌株的選育等方面[10-11]。有關(guān)中原地區(qū)濃香型白酒大曲中高產(chǎn)淀粉酶菌株的研究未見報(bào)道。試驗(yàn)擬以中高溫白酒大曲作為研究樣品，對(duì)成熟曲中高產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定并優(yōu)化產(chǎn)酶條件，為后續(xù)提高大曲液化力、糖化力提供菌種，以便有效控制制曲工藝與酒曲質(zhì)量，以期對(duì)提升白酒品質(zhì)和產(chǎn)量提供參照。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

中高溫白酒大曲：賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，20 g瓊脂，加水至1 L，121 ℃滅菌20 min[12];

種子培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，加水至1 L;

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，蛋白胨20 g，磷酸氫二鈉5 g，硫酸鎂0.1 g，氯化鈉0.1 g，pH 7.0[13]。

1.1.3 主要試劑、儀器

牛肉膏、蛋白胨：北京澳博星生物技術(shù)有限公司；

可溶性淀粉：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；

瓊脂粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鎂：分析純，西隴化工股份有限公司；

柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：天根生化科技有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：ZQLY-300S型，上海知楚儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9272型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：LDZM-60KCS型，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；

分光光度計(jì)：722S型，上海菁華科技儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HHS-21-6型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

(1) 初篩：無菌環(huán)境中，采用分區(qū)方法稱取曲皮、曲心共5 g，研磨后加入45 mL無菌水振蕩30 min，用梯度稀釋法逐級(jí)稀釋后，依次得到不同梯度的稀釋液(10-2～10-6)。取10-5，10-6各100 μL稀釋菌懸液涂布在淀粉培養(yǎng)基上，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d[14]。對(duì)培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行碘熏，菌落周圍如果有白色透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能生產(chǎn)淀粉酶[12]。

(2) 復(fù)篩：選取透明圈較明顯的菌株，用液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，然后以10%的接種量(250 mL三角瓶裝液量90 mL)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min，37 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用Yoo改良法[15]進(jìn)行淀粉酶活力測(cè)定。結(jié)合透明圈直徑/菌落直徑(D/d值)與酶活力大小確定高產(chǎn)淀粉酶菌株。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察、分子鑒定及生理生化試驗(yàn)

(1) 形態(tài)鑒定：將活化后的高產(chǎn)淀粉酶的菌株，用點(diǎn)接法接種到淀粉平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其形態(tài)特征并進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

(2) 分子生物學(xué)鑒定：利用柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，提取復(fù)篩得到的高產(chǎn)菌株的基因組DNA，并以獲得的DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATAGAGTTTGATC-3')/1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')為上/下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃下保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：Mix 25 μL，DNA樣品1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，蒸餾水20 μL。

應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。序列結(jié)果采用NCBI在線工具Blast在GeneBank內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，找出與克隆子序列同源性最高的序列，根據(jù)其同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并明確其分類地位。DNAMAN軟件對(duì)齊序列[16]，Mega 6.0軟件的鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

(3) 生理生化試驗(yàn)：結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]對(duì)高產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 6-10菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

(1) 碳源對(duì)淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：在液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入2%不同碳源(蔗糖、葡萄糖、玉米粉、麩皮、可溶性淀粉)替換產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源成分，進(jìn)行碳源優(yōu)化試驗(yàn)[20]。

(2) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：取無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為7，以10%的菌液接種量接種于三角瓶中進(jìn)行37 ℃，150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2，3，4，5，6 d后取出，進(jìn)行酶活力測(cè)定[20-21]，確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

(3) 初始pH對(duì)淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：取無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(初始pH分別為3，4，5，6，7)，以10%的菌液接種量接種于三角瓶中進(jìn)行37 ℃，150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)2 d后取出，進(jìn)行酶活力測(cè)定[22]，確定最優(yōu)初始pH。

(4) 接種量對(duì)淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：取無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為7，分別以4%，6%，8%，10%，12%的菌液接種量接種于三角瓶中進(jìn)行37 ℃，150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)2 d后取出，進(jìn)行酶活力測(cè)定[23]，確定最優(yōu)接種量。

(5) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響因素顯著的發(fā)酵條件，以酶活力為因變量，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)[24-25]，確定高產(chǎn)淀粉酶菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

樣品經(jīng)涂布和多次純化后，進(jìn)行固體碘熏蒸試驗(yàn)(見圖1)。經(jīng)初步篩選共有100株菌株產(chǎn)生了透明圈，其中D/d值>2.5的菌株共有6株，分別命名為6-8、6-10、26、29、32、35；其中D/d值最大的為6-10(表1)。

2.2 淀粉酶活力測(cè)定

對(duì)6株菌株進(jìn)行搖床發(fā)酵，采用Yoo改良法測(cè)定酶活，結(jié)果如表2所示。從表2可以得出，菌株6-10的酶活最大可達(dá)37.13 U/mL，與透明圈的有效值大小相符。李蘭等[12]從白酒大曲中分離出產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌最高初始酶活為33.65 U/mL，唐麗江等[26]篩選的產(chǎn)酶活性最高的Pab03、Pab02枯草芽孢桿菌在未優(yōu)化前酶活力分別為31.33，21.52 U/mL，均低于試驗(yàn)未優(yōu)化前菌株6-10的酶活。

表1 透明圈與菌落直徑Table 1 The diameter of colony and transparentcirde

圖1 淀粉酶菌株產(chǎn)生的透明圈Figure 1 The transparent ring produced by the amylase strain

表2 粗酶液酶活力測(cè)定結(jié)果Table 2 The determination result of enzyme activity in impure enzyme liquid U/mL

2.3 高產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的形態(tài)與分子學(xué)鑒定及生理生化試驗(yàn)

2.3.1 形態(tài)鑒定 將菌株6-10活化后在淀粉平板培養(yǎng)基上點(diǎn)接觀察其菌落形態(tài)特征(見圖2)。菌落顏色為乳白色，表面濕潤(rùn)較稠密，粗糙且邊緣不規(guī)則有皺紋，菌落呈圓形中間凹陷呈火山口狀。進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)(見圖3)。菌體呈紅色，為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞形態(tài)為短桿狀。

圖2 6-10菌落形態(tài)圖Figure 2 Colony morphology of 6-10

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 提取6-10菌株的16S rDNA，PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)(見圖4)，將擴(kuò)增的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索相似序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 6.0軟件的鄰位法(見圖5)。

由圖4可知，基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到1 500 bp 的目的DNA片段。

由圖5可知，菌株6-10與Bacillusvelezensis同源性為99%，鑒定菌株6-10為芽孢桿菌屬。

2.3.3 生理生化試驗(yàn) 如表3所示，6-10菌株可水解淀粉、甲基紅、明膠，不能產(chǎn)氨、抗酸、反硝酸化。結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果和16S rDNA分子鑒定，可確定6-10為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

圖3 6-10革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)Figure 3 6-10 Gram stained cell morphology (×1 000)

圖4 PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)Figure 4 PCR amplification electrophoresis

圖5 菌株6-10系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Strain 6-10 phylogenetic tree

表3 6-10菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of the strain

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種[27-28]，不僅具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶能力，而且可以水解淀粉、血液、明膠等，目前對(duì)其產(chǎn)淀粉酶能力尚未見深入研究。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)在農(nóng)業(yè)上還有促使植物生長(zhǎng)和抵抗病原微生物作用，在提高糧食產(chǎn)量、質(zhì)量和生物農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用上潛力無窮[29]。

2.4 6-10菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 由圖6可知，6-10菌株的最適碳源為可溶性淀粉，最適發(fā)酵時(shí)間為4 d，最適初始pH為4，最適接種量為10%。

2.4.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量3個(gè)具有顯著影響的因素作為自變量，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5。

采用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到酶活對(duì)自變量發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量的多元回歸方程為：

Y=164.46+8.28A+3.22B-0.97C+19.91AB-5.49AC+4.8BC-22.41A2-22.62B2-3.65C2。

(1)

由表6可知，回歸模型F值為22.4，且顯著性檢驗(yàn)為極顯著(P=0.000 2)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.112 4>0.05)，說明該模型真實(shí)。回歸方程決定系數(shù)R2=0.966 4，表明響應(yīng)值+酶活真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度和可靠度，該方案是可行的。

2.4.3 酶活的響應(yīng)曲面分析 圖7為發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量3個(gè)因素兩兩之間交互作用對(duì)淀粉酶菌株酶活的影響。

由圖7可知，發(fā)酵時(shí)間和初始pH兩兩之間存在顯著的交互影響，發(fā)酵時(shí)間和接種量、初始pH和接種量存在交互影響，證明了響應(yīng)面曲線分析結(jié)果的切實(shí)性。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 4 Box-Behnken horizontal design table of experimental factors

圖6 6-10菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果Figure 6 Single factor test results of optimized enzyme production conditions of strain 6-10

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

2.4.4 發(fā)酵最佳條件確定及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 采用Design Expert 8.0.5軟件優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，分析結(jié)果為：發(fā)酵時(shí)間4.29 d，pH 5.17，接種量9.52%。此條件下，模型預(yù)測(cè)值酶活為165.98 U/mL。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得預(yù)測(cè)值的可靠性，采用上述試驗(yàn)條件進(jìn)行發(fā)酵的工藝驗(yàn)證，考慮到試驗(yàn)中實(shí)際操作的方便，將最佳條件修改為發(fā)酵時(shí)間4 d，pH 5，接種量10%，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的酶活平均值為(164.37±3.25) U/mL，與預(yù)測(cè)值基本靠近，說明所建模型擬合優(yōu)良且真實(shí)。

表6 響應(yīng)面回歸方程的方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

圖7 發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量3個(gè)因素兩兩之間交互作用對(duì)淀粉酶菌株酶活的影響Figure 7 Effect of interaction between three factors, namely fermentation time, initial pH and inoculum, on enzyme activity of amylase strain

3 結(jié)論

試驗(yàn)從大曲中篩選產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌，利用透明圈和Yoo改良法測(cè)定酶活，選出高產(chǎn)菌株6-10，結(jié)合形態(tài)觀察和16S rDNA同源序列分析以及生理生化試驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，通過單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)得到6-10最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間4 d，pH 5，接種量10%。優(yōu)化后產(chǎn)酶能力達(dá)到(164.37±3.25) U/mL是優(yōu)化前酶活37.13 U/mL的4.43倍，具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶能力。

試驗(yàn)僅研究了貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的高產(chǎn)淀粉酶能力，后續(xù)將對(duì)其他性能進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步發(fā)掘其應(yīng)用潛力。