人TBC1D10C基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定

程闊菊 吳慶 周殿儒 馮勝紅 羅健華 黃河 王毅

【摘要】目的 構(gòu)建人TBC1D10C（hTBC1D10C） 基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定。方法 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hTBC1D10C基因片段，構(gòu)建pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒，將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒和系統(tǒng)包裝質(zhì)粒應(yīng)用高效轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，以包裝rLV-hTBC1D10C-zpp，在HEK293細(xì)胞中檢測(cè)病毒滴度。rLV-hTBC1D10C-zpp感染H9C2心肌細(xì)胞，蛋白免疫印跡法檢測(cè)hTBC1D10C 蛋白表達(dá)。結(jié)果 pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，rLV-hTBC1D10C-zpp包裝順利，滴度為1×108 TU/ml，感染H9C2心肌細(xì)胞后，hTBC1D10C蛋白表達(dá)上調(diào)（P < 0.05）。結(jié)論 rLV-hTBC1D10C-zpp構(gòu)建成功，在心肌細(xì)胞中具有高效表達(dá)hTBC1D10C的效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】人TBC1D10C;Carabin;慢病毒載體

【Abstract】Objective To construct a lentivirus vector overexpressing human TBC1D10C （hTBC1D10C） gene and identify its function. ?Methods The hTBC1D10C gene fragment was amplified by PCT. Human TBC1D10C gene fragment was inserted into the vector overexpressing pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro. Then， the vector plasmid overexpressing pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro and system packaging plasmid were transfected into 293T cells using HET high-efficiency transfection reagent to package rLV-hTBC1D10C-zpp. The viral titer was detected in HEK293 cells. H9C2 myocardial cells were infected with rLV-hTBC1D10C-zpp. The expression level of hTBC1D10C protein was detected by Western blot. ?Results The plasmid overexpressing pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro was successfully constructed. rLV-hTBC1D10C-zpp was successfully packaged with a titer of 1x108TU/ml. The expression level of hTBC1D10C protein was significantly up-regulated after H9C2 myocardial cells were infected （P < 0.05）. Conclusion rLV-hTBC1D10C-zpp is successfully constructed， which can overexpress hTBC1D10C in cardiomyocytes.

【Key words】Human TBC1D10C;Carabin;Lentivirus vector

TBC1D10C是2007年在人T淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的鈣調(diào)磷酸酶（CaN）結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于脾臟及血液中，同時(shí)可與Ras結(jié)合，基于其與CaN和Ras均能相互作用的特性，將其命名為carabin[1]。有研究表明，它作為CaN的內(nèi)源性負(fù)反饋抑制蛋白通過(guò)CaN和Ras信號(hào)通路負(fù)反饋抑制T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的持續(xù)活化，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用[2-4]。最近研究表明，TBC1D10C在心肌細(xì)胞中亦有表達(dá)，可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)CaN和Ras信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞的肥大，并有可能成為診治心力衰竭的心肌肥厚靶點(diǎn)[5-6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，TBC1D10C在小鼠梗死心臟及經(jīng)缺血/缺氧處理的人心室肌細(xì)胞株AC16中表達(dá)均顯著下調(diào)，提示TBC1D10C在心肌梗死及缺血中可能會(huì)起到一定的作用，但目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道[7]。鑒于此，本研究擬采用慢病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建人TBC1D10C慢病毒過(guò)表達(dá)載體（rLV-hTBC1D10C-zpp），感染H9C2心肌細(xì)胞驗(yàn)證TBC1D10C過(guò)表達(dá)效果，為進(jìn)一步觀察TBC1D10C信號(hào)通路在心肌細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材 料

1. 材 料

293T細(xì)胞株及慢病毒過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒（pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro， Amp+）購(gòu)自深圳百恩維生物科技有限公司。pUC57-hTBC1D10C質(zhì)粒（hTBC1D10C模板質(zhì)粒）由本實(shí)驗(yàn)室提供。

2. 主要試劑及儀器

JM109感受態(tài)細(xì)胞（深圳百恩維生物科技有限公司），DNA引物合成（美國(guó)Invitrogen公司），DNA測(cè)序（美國(guó)Invitrogen公司），限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ（美國(guó)NEB公司），胎牛血清（C2027050，美國(guó)Invitrogen公司），慢病毒包裝試劑盒（BW12008-20，深圳百恩維生物科技有限公司），超凈工作臺(tái)BCM-1600A（蘇州蘇凈安泰公司），Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Imager，Gel-Doc（美國(guó)Bio-Rad公司）。

3. 引物設(shè)計(jì)及合成

針對(duì)pUC57-hTBC1D10C質(zhì)粒設(shè)計(jì)基因引物：pUC57-hTBC1D10C-EcoRⅠ-F：5-CCGGAATT-CGCCACCATGGCCCAGGCCCTGGGGGAG-3;pUC57-hTBC1D10C-BamHⅠ-R：5-CGCGGATCC-TCAGAAGCGGGTGTCCAGGAAGGAGGTG-3（加粗標(biāo)記位點(diǎn)為酶切位點(diǎn)）。引物的設(shè)計(jì)和合成由美國(guó)Invitrogen公司完成。

二、方 法

1. pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增在引物中引入了EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的hTBC1D10C，瓊脂糖凝膠回收目的條帶，提取目的基因NDA。對(duì)載體質(zhì)粒pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro和回收的目的hTBC1D10C基因行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切片段在T4 DNA Ligase的作用下連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)菌，接種于含Amp+的培養(yǎng)基平板，次日挑選陽(yáng)性單克隆菌群，Amp+藥液培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性后送美國(guó)Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2. rLV-hTBC1D10C-zpp慢病毒的包裝、收集、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

將攜帶目的hTBC1D10C基因的重組質(zhì)粒pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro以及系統(tǒng)包裝質(zhì)粒用高效轉(zhuǎn)染試劑盒（HET）轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 ～ 16 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，換液后24 h收集病毒上清液置4℃冰箱保存，加入10 ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞和上清液置于離心管中，凍融3次與之前的病毒上清液合并，2000 rpm 離心 5 min，取上清即為病毒液初代原液。連續(xù)三代反復(fù)擴(kuò)增收集病毒后，行病毒的大量擴(kuò)增，對(duì)其純化和濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在人胚腎組織細(xì)胞293（HEK293）細(xì)胞中按照慢病毒包裝試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度。

3. rLV-hTBC1D10C-zpp 功能鑒定

H9C2傳代至108/L時(shí)接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，每孔加入含1×105/L病毒的100 μl病毒液，孵育4 h后更換培養(yǎng)基，40 h后收集蛋白，蛋白免疫印跡法檢測(cè)hTBC1D10C 蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn);非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro載體的構(gòu)建DNAMAN 比對(duì)分析pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro質(zhì)粒的基因測(cè)序結(jié)果，結(jié)果顯示與hTBC1D10C序列一致（見(jiàn)圖1），表明載體構(gòu)建成功。

二、rLV-hTBC1D10C-zpp慢病毒的包裝、收集、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

將制備的重組質(zhì)粒pLVX-hTBC1D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro以及系統(tǒng)包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，分別于24 h及48 h時(shí)進(jìn)行收集。在HEK293細(xì)胞中按照慢病毒包裝試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度。慢病毒rLV-hTBC1D10C-zpp滴度為：1×108 TU/ml，見(jiàn)圖2。

三、rLV-hTBC1D10C-zpp 功能鑒定

將構(gòu)建成功的rLV-hTBC1D10C-zpp感染H9C2心肌細(xì)胞，48 h后提取總蛋白行蛋白免疫印跡法驗(yàn)證。結(jié)果顯示，hTBC1D10C過(guò)表達(dá)組hTBC1D10C蛋白比對(duì)照組上升（t = 9.574，P < 0.001）。蛋白免疫印跡法驗(yàn)證hTBC1D10C過(guò)表達(dá)成功，結(jié)果見(jiàn)圖3。

討論

TBC1D10C是2007年P(guān)an等[1]用酵母雙雜交技術(shù)在人T淋巴細(xì)胞中對(duì)CaN結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的CaN結(jié)合蛋白，同時(shí)可與Ras結(jié)合。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，TBC1D10C蛋白含有一個(gè)CaN 結(jié)合區(qū)域和一個(gè)Ras結(jié)合區(qū)域：CaN結(jié)合區(qū)域位于羧基端，其最小結(jié)合區(qū)域?yàn)轸然┒说?1個(gè)氨基酸殘基（aa406-446）;Ras結(jié)合區(qū)域?yàn)榘被说?9位到294位氨基酸（aa89-294）[1]。經(jīng)在體和離體實(shí)驗(yàn)的功能鑒定：①CaN 結(jié)合區(qū)域，TBC1D10C的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)依賴于CaN信號(hào)通路的活化，而產(chǎn)生的TBC1D10C可與CaN結(jié)合，進(jìn)而抑制CaN信號(hào)通路，因此TBC1D10C是作為CaN的負(fù)反饋抑制蛋白來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用的;②Ras結(jié)合區(qū)域，具有Ras GAP活性，可特異性地抑制Ras/ERK1/2信號(hào)通路。前期研究表明，在T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞中TBC1D10C作為CaN的內(nèi)源性負(fù)反饋抑制蛋白通過(guò)CaN-NFAT和Ras/ERK1/2信號(hào)通路負(fù)反饋抑制T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的持續(xù)活化，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用[1-4]。最近研究表明，TBC1D10C在心肌細(xì)胞中亦有表達(dá)，可通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)CaN-NFAT、Ras/ERK1/2CaN及Ras-CaMKⅡ信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞的肥大，并有可能成為診治心衰的心肌肥厚靶點(diǎn)[5-6]。

我們的前期研究顯示，在小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗死動(dòng)物模型中，術(shù)后第7日及第14日梗死區(qū)域TBC1D10C的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，同時(shí)在經(jīng)缺血/缺氧處理的人心室肌細(xì)胞株AC16中表達(dá)亦均顯著下調(diào)[7]。那么下調(diào)的TBC1D10C在心肌梗死中是否會(huì)起到一定的作用呢，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。如前所述，TBC1D10C為一新發(fā)現(xiàn)的蛋白，目前尚未發(fā)現(xiàn)其特異性激活劑，鑒于此，本研究利用慢病毒載體，定向克隆人TBC1D10C基因，以此達(dá)到TBC1D10C過(guò)表達(dá)的作用，為TBC1D10C的研究奠定基礎(chǔ)。

伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，各種可以改變基因表達(dá)水平的手段和方法日趨進(jìn)步。目前，用于外源性基因?qū)氲妮d體主要包括質(zhì)粒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。與其他載體相比，慢病毒載體對(duì)非分裂和分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主細(xì)胞染色體上，使外源性基因能長(zhǎng)期穩(wěn)定的高效表達(dá)[8-10]。使得慢病毒成為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定高效表達(dá)的理想載體。因考慮后期研究涉及動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染效率要求高，因此研究組決定采用腺病毒載體構(gòu)建人TBC1D10C過(guò)表達(dá)載體。

在rLV-hTBC1D10C-zpp構(gòu)建過(guò)程中，我們首先將人TBC1D10C基因定向克隆至pLVX-hTBC1-D10C-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后與系統(tǒng)包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 ～ 48 h后收集病毒原液，再連續(xù)三代反復(fù)行病毒擴(kuò)增。病毒滴度測(cè)定后，感染H9C2心肌細(xì)胞行rLV-hTBC1D10C-zpp功能鑒定，蛋白免疫印跡法驗(yàn)證hTBC1D10C過(guò)表達(dá)成功說(shuō)明rLV-hTBC1D10C-zpp構(gòu)建成功。rLV-hTBC1D10C-zpp的成功構(gòu)建為TBC1D10C在心肌梗死及缺血中的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Pan F， Sun L， Kardian DB， Whartenby KA， Pardoll DM， Liu JO. Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin. Nature， 2007， 445（7126）：433-436.

[2] Schickel JN， Pasquali JL， Soley A， Knapp AM， Decossas M， Kern A， Fauny JD， Marcellin L， Korganow AS， Martin T， Soulas-Sprauel P. Carabin deficiency in B cells increases BCR-TLR9 costimulation-induced autoimmunity. EMBO Mol Med， 2012， 4（12）：1261-1275.

[3] Jiang W， Zhou X， Li Z1， Liu K， Wang W， Tan R， Cong X， Shan J， Zhan Y，Cui Z， Jiang L， Li Q， Shen S，Bai M，Cheng Y，Li B， Tan M， Ma DK， Liu JO， Dang Y. Prolyl 4-hydroxylase 2 promotes B-cell Lymphoma progression via hydroxylation of Carabin. Blood，2018， 131（12）：1325-1336.

[4] Hsu C， Morohashi Y， Yoshimura S， Manrique-Hoyos N， Jung S， Lauterbach MA， Bakhti M， Gr?nborg M， M?bius W， Rhee J， Barr FA， Simons M. Regulation of exosome secretion by Rab35 and its GTPase-activating proteins TBC1D10A-C. J Cell Biol， 2010， 189（2） ： 223-232.

[5] Bisserier M， Berthouze-Duquesnes M， Breckler M， Tortosa F， Fazal L，de Régibus A， Laurent AC， Varin A， Lucas A， Branchereau M， Marck P， Schickel JN， Deloménie C， Cazorla O，Soulas-Sprauel P， Crozatier B， Morel E，Heymes C， Lezoualch F. Carabin protects against cardiac hypertrophy by blocking calcineurin， Ras， and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II signaling. Circulation，2015， 131（4）：390-400.

[6] Yi X， Li X， Jiang X. Carabin： endogenous calcineurin inhibitor， a potential diagnostic and therapeutic target for cardiac hypertrophy in heart failure. Int J Cardiol， 2016， 212：57-58.

[7] 吳慶，姚浩旗，程闊菊， 唐建芳，黃河，陳建，李洪，楊天德. Carabin 過(guò)表達(dá)對(duì)人心室肌細(xì)胞 AC16 氧糖剝奪后凋亡的影響. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 40（22）：2068-2073.

[8] 雷梅先. 慢病毒介導(dǎo)LXRs過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制. 南昌：南昌大學(xué)， 2014.

[9] 彭丹， 鐘小敏. 應(yīng)用雙靶標(biāo)CRISPR慢病毒載體在間充質(zhì)干細(xì)胞中穩(wěn)定敲除lncRNA DANCR基因. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2019， 40（1）：15-22.

[10] 王萱， 易寰， 劉佳， 李敏，彭福華. 慢病毒介導(dǎo)BTLA轉(zhuǎn)染未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的研究. 新醫(yī)學(xué)， 2015， 46（12）：803-807.

（收稿日期：2019-08-12）

（本文編輯：楊江瑜）