利用KASP標記定位小麥群體中的無芒位點 Awn-4A.1

2020-03-05 03:08:38蔣鈺婕王君哲趙佳男許盛寶

麥類作物學報 2020年10期

蔣鈺婕，王君哲，趙佳男，許盛寶

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

芒作為小麥穗部器官的組成之一，是小麥長期進化和適應環境的結果[1]。但由于芒不利于收割和儲藏，經過數千年的人類選擇，馴化的小麥(硬粒小麥和普通小麥)出現了短芒甚至無芒[2]。然而，芒的存在也有利于小麥的生長發育，同葉一樣，芒也是光合作用的重要器官[2-4]，由于芒的光合面積大，處于光照的最佳位置，距離籽粒近，對于促進籽粒灌漿和提高粒重具有重要的作用[5]；芒中非綠色組織的細胞，尤其是表皮細胞的細胞壁增厚，有利于減少水分的蒸發[6]，在干旱條件下，芒對小麥有較明顯的增產作用[7]。因此，芒對小麥適應干旱脅迫、促進籽粒灌漿和提高粒重均有重要意義[8-9]。

麥芒根據長度和形態，可以分為長芒、短芒、無(頂)芒、勾曲芒、短曲芒、長曲芒等多種形式[10]，主要由五個基因(A、B1、B2、B3和Hd)及多個微效基因共同決定[10]，其中，A基因促進芒的伸長，Hd基因促進鉤芒的形成，B1、B2和B3可抑制芒的發育，且B1的抑制作用最強，B2其次，B3最弱[11]。B1可以使穗中下部完全無芒，只有頂部少量芒，位于5A染色體長臂末端，目前已克隆了候選基因TraesCS5A02G542800[12-13]；B2可以使整個穗部的芒長變短，定位在6B染色體 4.84 Mb的物理區間內[11]；B3控制頂部的芒長，但目前定位還不清楚；Hd也會對芒長產生抑制作用，可通過與B1、B2的組合來產生不同類型的芒[14]，定位于4A染色體上[15]。由此可見，芒長發育具有位置效應，而且芒長表型是由多基因互作的結果。中國春作為普通小麥的模式品種，是一個典型的無芒小麥品種。前人發現，當中國春的缺體系染色體3BS[16]、4AS[14]和6BL[14]分別缺失后，頂部都出現了芒；當染色體5AL缺失后，中部有芒伸出，表明目前已知的芒長基因并不全面，還有很多與芒長相關的基因尚未發現，從而限制了對芒長發育的分子基礎與芒長基因的互作研究[14]。

SNP芯片技術作為一種高通量、低成本的基因自動分型檢測方法，目前已被廣泛用于小麥等多倍體作物的遺傳研究[17]、小麥連鎖圖譜的構建[18]、種群結構分析[19]和小麥基因定位[20]。用SNP芯片結合傳統的集群分離分析法 (bulked segregation analysis，BSA)，可快速檢測2個不同表現型構建的混合池間的遺傳差異，發現與目標性狀顯著關聯的差異SNP的染色體富集區域，在富集區域內開發標記，可進行SNP基因分型[21]；再結合競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)，可實現基因的精細定位和進一步SNP分型[22-23]。

本研究利用小麥無芒品種中國春和有芒品種MK147構建F2分離群體與重組自交系群體，用F2代分離群體中無芒與有芒株系分別構建DNA極端性狀混合池，利用Wheat660K SNP芯片進行基因分型，并對其結果進行BSA分析，對群體中有關芒長的QTL進行初步定位；用KASP標記進行QTL驗證和精細作圖，并開發與之緊密連鎖的分子標記，以期為分析芒形成的遺傳機制和分子標記輔助選擇育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國春(Chinese Spring， CS)是測序完成的模式小麥品種，MK147是由國際農業研究中心(International Center for Agricultural Research，ICARDA)引進的小麥耐熱性品系[25-26]。本研究利用這兩個普通小麥品種(系)作為親本進行雜交，獲得F1，自交得到F2分離群體，通過單粒傳法，得到了MK147/CS組合的F5代重組自交系(RIL)群體。親本中的CS屬于無芒材料，盡管CS一直被認為是無芒的小麥，但其實頂部有很短的芒(頂部芒長<0.6 cm)，因此，本研究用頂部芒長小于0.6 cm作為無芒的標準。MK147屬于長芒材料(芒長>4 cm)。F2群體及親本于2016年10月至2017年6月種植于西北農林科技大學北校區試驗地(陜西楊凌)。RIL群體及親本于2018年10月至2019年6月種植于西北農林科技大學曹新莊試驗地(陜西楊凌)。F2和RIL群體均按單粒播種的方式種植，RIL群體的每個株系種植成株行，行長2.0 m，行間距0.25 m，株距0.15 m，試驗設置3次重復，田間管理按當地大田常規標準進行。

1.2 表型測定

于小麥蠟熟期，F2群體每個單株隨機選取三個穗，RIL群體每個株系隨機選取3個主莖穗，使用直尺分別測量小麥穗部上、中、下三部分的芒長；每個部分隨機選取3個芒，取平均值作為該部分的平均芒長，用于表型及遺傳分析。

1.3 DNA提取及混池構建

根據 F2分離群體的表型鑒定結果，從群體中隨機選取15個無芒單株和15個有芒單株構建極端池。分別取新鮮嫩綠的葉片，使用CTAB法提取DNA[27]，用紫外分光光度計檢測DNA濃度，再等量混合形成無芒池和長芒池。

1.4 SNP芯片分型及BSA分析

用Wheat660K SNP芯片(https://wheat.pw.usda.gov/ggpages/topics/Wheat660_SNP_array_developed_by_CAAS.pdf)進行混池SNP分型檢測(北京博奧晶典生物技術有限公司)。利用Excel 2019軟件處理SNP分型數據，剔除無多態性及低質量的SNP，篩選得到親本及無芒、長芒池間純合且有差異的SNP。參照中國春IWGSC.Ref.V1.0(http://www.wheat genome.org/) ，將差異SNP側翼序列與基因組進行BLAST，獲得SNP的物理位置信息。參考Wu等[24]的方法，設計Perl腳本計算目標染色體上每Mb中SNP數量進行滑窗統計，根據標記密度評估可能的目標區間。

1.5 KASP-SNP標記開發及初定位結果驗證

根據SNP物理位置的分布和密度，使用在線平臺PolyMarker網站(http://polymarker.tgac.ac.uk/)對候選SNP進行KASP設計，從中挑選出染色體特異的標記。在KASP標記正向引物5′ 端分別加上FAM或HEX熒光的接頭序列，其中FAM接頭序列為5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX接頭序列為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。將KASP標記在群體中進行單倍型分析，若能將SNP的不同基因型區分開，說明該標記具有特異性，可以用來進行分子輔助選擇。定位區間左側標記SNP-1537引物序列為：1537F_FAM：CGTGTCAAAAGTTCTGACGAC；1537F_HEX：CGTGTCAAA-AGTTCTGACGAA；1537R：GTATCGTCT- CGTTGCACAGT。右側標記SNP-4195引物序列為：4195F_FAM：GTGAAGTACAAGGATGAGGTGAAA；4195F_HEX：GTGAAGTACAAGGATGAGGTGAAG；4195R:CTCCCACATCTTGACGAGCA。

2 結果與分析

2.1 群體中芒長的遺傳分析

CS為無芒品種，與有芒品系MK147雜交，F1代全部表現為有芒，但均為短芒，芒長顯著短于有芒親本(圖1A)，表明CS中無芒性狀受半顯性單基因控制。芒在穗的不同位置長度不同，其中MK147中部最長，下部最短；而雜交F1代上部最長，下部最短(圖1B)。

在F2群體中芒長呈現連續的變化(圖2A)。無芒與有芒的株系在F2代中接近1/4的比例(表1)，表明群體中的無芒性狀可能是由一個基因控制。在RIL群體中，以頂部芒長小于0.6 cm作為無芒標準，發現無芒株系有58個、有芒株系有62個，比例接近1∶1的比例(圖2B)，進一步說明了群體中的無芒性狀由單基因控制。

2.2 混合池構建結果和BSA分析

在MK147/CS的混池中篩選到8 904個有差異的SNP標記(圖3A)。其中4 281個差異SNP集中分布在4A染色體上(圖3B)，且差異SNP與總SNP的比例在4A染色體上最高，表明群體中控制芒長的QTL位于4A染色體。通過對4A染色體上每Mb中SNP數量進行滑窗統計，發現4A上的差異SNP大部分富集在37～105 Mb和446～468 Mb區間，表明4A染色體上有兩個候選位點(圖3C)。

2.3 定位區間的驗證與縮小

根據Wheat660K 芯片在兩個富集區間的SNP序列信息，開發了58個KASP標記，將這些標記在MK147/CS雜交的F2代群體458個株系中進行基因型檢測，結果發現，無芒性狀與37～105 Mb區間連鎖更為緊密，定位于KASP標記SNP-1537與SNP-4195之間0.81 cM的遺傳區間，對應于中國春參考基因組(IWGSC.Ref. V1.0)4A染色體上9.23 Mb(100.56～109.79 Mb)的物理距離(圖4)，利用標記SNP-1537與SNP-4195對RIL群體的無芒和有芒株系進行基因型檢測(圖5)，其中，標記SNP-1537檢測了121個株系，基因型和表型一致的達91.74%；標記SNP-4195檢測了137個株系，基因型和表型一致的達94.89%。因此，再次驗證了群體中芒抑制基因位點位于4A染色體上，并將其命名為Awn-4A.1，同時發現兩個與Awn-4A.1緊密連鎖的KASP標記SNP-1537和SNP-4195。

3 討論

芒長基因在生產上既有應用價值，也是研究小麥基因互作的一個重要表型。杜斌等[10]研究發現，影響芒長的位點由多個基因共同控制。中國春中不同染色體的缺失均造成其無芒表型發生改變，表明還有許多與芒長相關的基因參與芒的發育，從而限制了對芒長這一性狀發育的分子基礎與互作機制的研究[14]。

圖1 親本和F1代芒長表現(A)及芒長統計(B)

A:F2群體；B：RIL群體。

表1 F2群體芒長的遺傳分析及卡方檢驗結果

A：親本與F2混池差異SNP的重疊關系；B：篩選的SNP在染色體上的分布，折線表示差異SNP與總SNP數的比例；C：4A染色體差異SNP的物理位置和密度，框表示SNP顯著富集的區域。

本研究中發現的位于4A染色體上控制芒長的位點，是對全穗芒長的抑制，且表現為半顯性，這與前人報導的五個芒長基因(A、B1、B2、B3和Hd)的表現都不同[11-15]，可能是一個新的芒長位點；Sourdille等[14]和宮希等[15]研究發現，定位于4A染色體上的Hd也會對芒長產生抑制作用，但控制鉤芒的形成[14-15]，與本研究中的芒長表型不同，可能不是同一個基因。因此，推測在中國春4A染色體上可能存在與Hd不同的另外一個基因來調控芒長，在抑制芒發育的過程中，可能一起發揮作用。

芒長是由多基因共同控制，這些基因間存在著復雜的相互作用。本研究鑒定到的位點定位于4A染色體上0.81 cM的遺傳區間，對應中國春(IWGSC.Ref.V10)參考基因組9.23 Mb的物理位置，區間內含有多個候選基因，為進一步精細定位與克隆基因提供了基礎。目前還未研究該位點與其他已知芒長位點的互作效應，但該位點能夠抑制全穗芒長，因此，推測該位點可能在芒發育調控網絡中處于較為核心的位置，深入研究將有助于建立芒發育基因的調控主線，以及逐步解析小麥芒長的基因互作機制。