lncRNA-miRNA與膠質瘤作用機制的研究進展

柴洋 綜述 謝明祥 審校

(遵義醫科大學附屬醫院神經外科，貴州 遵義 563003)

中樞神經系統(CNS)中最具侵襲性的原發性腫瘤是神經膠質瘤，約占所有侵襲性神經系統腫瘤的50%～80%[1]并且逐年遞增[2-3]。其中，WHO定義為Ⅳ級的膠質母細胞瘤(GBM)，約80%為浸潤性星形細胞瘤，是目前病理診斷級別惡性程度最高的惡性膠質瘤。人類基因組中98%以上的核苷酸序列不編碼蛋白質，其轉錄產物為ncRNA(ncRNA)。各種研究表明，ncRNA據片段大小劃分出來的微小RNA (miRNA)和長鏈非編碼RNA (lncRNA)，這兩種RNA調控多種蛋白編碼基因。lncRNA可以作為分子誘餌，通過直接吸附miRNA來有效抑制miRNA與靶mRNA的相互作用。本文主要對lncRNA-miRNA與膠質瘤作用機制作一綜述。

1 lncRNA及其功能

1.1lncRNA 自20世紀90年代以來，Okazaki等對老鼠的全長cDNA進行大規模測序時發現了lncRNA到在老鼠中發現了H19和X(染色體)失活特異性轉錄物(Xist)，隨著越來越深入的研究，過去被當做“克隆文物”或者轉錄“噪音”的lncRNA重新獲得了人們的重視[4]。經科研人員多年的研究發現，lncRNA的長度超過200個核苷酸(nt)，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄合成，但lncRNA不參與蛋白質的翻譯過程且具有空間和時間的特異性。除了表達水平很低，核苷酸的數量比較少以及外顯子雖然長度更長但數量少以外，其他很多方面都與mRNA的序列類似[5]，同樣包含5’端帽結構，3’端多聚腺苷酸尾結構，內含子以及剪接位點。

多數lncRNA的二級結構相對保守，具有獨特的剪接形式以及特定的亞細胞定位，這種空間和時間的特異性可以說明lncRNA是具有許多功能的,但這種功能特性相對于許多miRNA和蛋白質來說很難完全確定。根據lncRNA相對于蛋白編碼基因進行轉錄的位置，可將其分為六類lncRNA：①Sense lncRNA(正義鏈RNA)：與編碼基因的一個或多個外顯子重疊；②Antisense lncRNA(反義鏈RNA)：與互補鏈上的轉錄產物進行部分或完全的互補；③Intronic transcript lncRNA(內含子lncRNA)：由基因的內含子產生；④Bidirectional lncRNA(雙向lncRNA)：由與蛋白編碼基因相同的啟動子轉錄而來，但是方向相反； ⑤Long intergenic noncoding RNA(長基因間lncRNA，lincRNA)：由位于蛋白質編碼基因之間的序列獨立轉錄產生；⑥Enhancer lncRNA(增強子lncRNA)：由位于增強子區域的蛋白編碼基因產生。根據lncRNA在腫瘤發生及其發展過程中所發生的作用，可將lncRNA劃分為癌基因以及抑癌基因lncRNA。值得注意的是，目前是不能僅根據序列特征或者結構形式來準確推測它們在其基因調控中所起的作用。

1.2lncRNA的功能 lncRNA不僅僅維持正常生理過程，與腫瘤發生、發展以及轉移的關系也被廣泛報道，因此成為近期的研究熱點。在表觀遺傳學水平上，可通過DNA甲基化、介導染色質重構以及組蛋白修飾，影響下游基因的正常表達。在轉錄水平上，位于啟動子區的編碼基因轉錄生成的lncRNA，可作為順勢作用原件去干擾下游基因的轉錄，進而影響mRNA的生成。另外，lncRNA可直接結合轉錄因子使其結構發生改變，轉錄因子因其活性降低而無法與目標基因結合，進而抑制了目標基因的表達。在轉錄后水平上，lncRNA通過與miRNA的前體(pre-miRNA)結合并進行配對，從而形成雙鏈復合物，影響其剪接、核內運輸以及降解等來調控基因的表達。lncRNA也可誘導某些基因位點形成異染色體，從而引發染色體重塑進而調控基因表達。

lncRNA因其不僅具有功能保守和調控嚴格的特性，還由于其空間和時間的特異性，使得lncRNA在正常生長發育以及某些惡性疾病的發生早期及其發展中都能起著重要的調控作用。從在小鼠體內發現了H19和Xist，直到最近十年，lncRNA在在癌癥發展中的作用才被提出來[6]，由于在體液中很容易檢測到lncRNA，因此lncRNA作為癌癥早期診斷、預后和癌癥治療的關鍵生物標記物尤其具有可觀的應用前景研究意義[7，8]。

2 miRNA及其功能

2.1miRNA 自1993年Lee等人在秀麗隱桿線蟲中發現的第1個miRNA到2001年Ambros實驗室創造了miRNA這個術語再到let-7的發現，就此展開了對miRNA的研究。miRNA在真核生物中廣泛存在，長度僅為18～25個nt，與lncRNA相同，都不參與蛋白質的翻譯過程即都是不編碼蛋白質的RNA。miRNA必須經過一個從初級(pre-)到前體(pri-)最后成熟的過程。首先，在細胞核中，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄生成加帽和多聚腺苷酸尾的初級miRNA(pri-miRNA)。接著pri-miRNA被酶-蛋白復合體：RNase Ⅲ DROSHA-DGCR8剪切成前體miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA是3’端有2個nt突出的發夾結構。然后生成的pre-miRNA經轉運蛋白Exportin-5-RanGTP轉運至細胞質后，最后被RNase Ⅲ DICER再次切割生成5’端有磷酸基團，3’端是羥基的成熟miRNA[9]。 多數miRNA序列高度保守，具有時間、空間、組織[10]以及疾病特異性。

2.2miRNA的功能 miRNA可調控約1/3的人類基因，多數成熟的miRNA與人類蛋白質AGO2結合并可以生成一種基因沉默復合體(RNA induced silencing complex，RISC)[9]，RISC通過miRNA 5’端的核苷酸序列與靶mRNA 3’端非翻譯區(untranslated region，UTR)特異結合后，可阻止靶基因的翻譯或直接降解靶基因。少數成熟的miRNA并不通過阻遏mRNA的翻譯行使調控作用，而是通過與核糖體蛋白mRNA的5’-UTR結合來促進核糖體蛋白合成。迄今為止，所有研究均表明miRNA在干細胞分化、發育、腫瘤的發生發展以及轉移耐藥中發揮著強大的基因調控作用，因此，miRNA可以作為診斷、預后和治療的生物標記物[11]。miRNA因具有組織特異性而同時既可作為癌基因，又可作為抑癌基因。在耐藥方面，miRNA可通過影響細胞自噬，導致靶基因表達自噬蛋白減少并增加細胞毒性起作用。并且經研究證明miRNA干預多條經典信號通路發揮其基因調控的作用，如作用于經典的p53和Wnt-β-catenin。

3 lncRNA與miRNA的相互作用

3.1lncRNA調控miRNA

3.1.1lncRNA作為miRNA的前體或宿主 pre-miRNA可通過lncRNA經細胞內剪切，或者其他基因在轉錄生成lncRNA的同時轉錄生成，但要獲得成熟的miRNA，還需要進一步的加工才能發揮作用。H19的加工產物miR-675，其堿基主要是C和G，而H19的堿基主要是G。雖然miR-675的前體是H19，但其兩者的序列、核苷酸組成有所不同，這可能是發揮不同功能所需要的結構基礎[12]。

3.1.2lncRNA與miRNA競爭性結合mRNA lncRNA和miRNA可競爭性與靶mRNA的3’UTR結合,進而抑制miRNA對靶基因的負向調控作用。β分泌酶編碼基因1(BACE1)是一種膜結合的天冬氨酸蛋白酶。能轉錄出一條長約2kb的Antisense lncRNA(BACE1-AS)。BACE1-AS水平上調增加BACE1的穩定性，并與BACE1 mRNA競爭性結合以抑制miR-285-5p結合并沉默BACE1的作用。

3.1.3lncRNA作為miRNA的海綿或者誘餌 lncRNA作為競爭性內源性RNA(ceRNA)以誘餌的方式吸附特定的miRNA，miRNA與lncRNA結合后既可通過順式作用直接作用于該lncRNA，也可通過反式作用間接作用于其他RNA，進而間接抑制miRNA靶基因表達的這種方式被稱為“海綿效應”(miRNA sponge)，lncRNA稱為“分子海綿”。

在經典的lin28/let-7信號通路中，lin28與let-7的前體結合。lin28有兩個高度保守的結合RNA的結構域，一個是位于氨基末端的冷休克結構域(CSD)，另一個是位于羧基末端的鋅指結構域(ZKD)，ZKD由兩個串聯的 CCHC(Cys-Cys-His-Cys)組成。pre-let-7 preE的loop環繞lin28的CSD，pre-let-7的3’-stem GGAG模體與lin28的ZKD結合后，lin28抑制let-7成熟從而實現lin28對let-7的抑制。

3.2miRNA調控lncRNA miRNA通過直接或間接作用于lncRNA，降低lncRNA的穩定性，進而調節lncRNA并影響生物進程。由于lncRNA也有3’UTR，因此miRNA可像作用與mRNA一樣與lncRNA的3’UTR結合從而直接抑制lncRNA。miRNA也可通過調節DNA甲基化酶(DNA methylase，DNMT)間接對lncRNA起調控作用。

4 linRNA-miRNA與膠質瘤的作用機制

雖然lncRNA與miRNA都可單獨作用于mRNA，但兩者的調控網絡并不是相互獨立的。在膠質瘤的發生發展中，lncRNA與miRNA的調控機制相互交織，并以依存的關系共同形成一個龐大的調控環路。

H19是母源性印跡基因，既有致癌又有抑癌的作用。研究人員發現，H19及由其衍生的miRNA-675在一些高級別惡性膠質瘤中的表達量明顯要高于低級別惡性膠質瘤。H19通過其生成的miRNA-675促進膠質瘤細胞的侵襲作用。更有實驗證實：抑制H19將抑制膠質瘤。熒光素酶實驗檢測到H19過表達以及miR-140下調，說明miR-140作為H19的靶點發揮促進膠質瘤細胞生長的作用[13]。血管生成抑制蛋白2(VASH2)與血管內皮生長因子(VEGF)共同調節膠質瘤血管的生成。VASH2通過H19-miR-29a通路上調以促進膠質瘤血管的生成。

母系表達基因3(MEG3)是一種抑制腦腫瘤的lncRNA，在腦膠質瘤細胞中的表達低于正常大腦組織。miR-19a主要發揮是其作為致癌基因的作用，促進膠質瘤的增殖、遷移和侵襲。PTEN基因(PTEN)，又稱為MMAC1和TEP1。miR-19a通過抑制PTEN起作用。MEG3通過抑制miR-19a的表達抑制膠質瘤細胞的增殖，使細胞周期停滯在G0/G1期[14]。此外，miR-93在膠質瘤中呈現高表達，可通過磷脂酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(P13K/AKT)信號通路促進惡性膠質瘤的早期發生及其發展，MEG3可通過抑制miR-93，進而抑制P13K/AKT信號通路最終發揮抑制惡性膠質瘤發生的作用[15]。

肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)是一種核內lncRNA，最初在研究其與人體肺癌轉移關系時才被發現。與正常人大腦神經組織相比，在惡性膠質瘤中顯著升高，并與腫瘤惡性程度、大小成正比，與膠質瘤患者的總生存期(OS)成反比。MALAT1通過抑制miR-101增加其靶基因STMN1、RAB5A以及ATG4D的表達。即通過MALAT1-miR-101-STMN1/RAB5A/ATG4D調控網絡激活膠質瘤細胞的自噬，并通過上調膠質瘤細胞中STMN1、RAB5A和ATG4D的表達而達到促進膠質瘤細胞增殖的作用[16]。另外，發現敲除MALAT1能夠上調miR-140，削弱膠質瘤細胞的免疫屏障作用，由此可有效提高膠質瘤細胞對藥物化療的免疫反應性。近期研究還初步發現,MALAT1還可通過抑制miR-155的表達對膠質瘤細胞起作用，敲低MALAT1可促進膠質瘤細胞的凋亡。

膠質瘤干細胞(GSCs)因其強大的自我更新以及分化能力，常常導致極差的預后以及短期內復發。lncRNA能夠調節GSCs：MALAT1可與miR-129結合，通過降低miR-129提高其靶基因SOX2的表達，調節GSCs的特性及膠質瘤細胞的形成、增殖和遷移[17]。在GSCs中呈高表達的核富集常染色體轉錄物 1(NEAT1)，則是通過miR-107-CDK6通路，激活miR-107使得周期蛋白依賴性激酶(CDK)失活。NEAT1在敲除后，細胞周期可停滯在G1期[18]。

從X染色體失活中心轉錄得來的Xist，其主要作用是調節X染色體的失活。Xist在惡性膠質瘤中呈現高表達，促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲，并增加膠質瘤細胞對化療藥替莫唑胺的耐藥性[19]。其可能機制是Xist作為miR-137的ceRNA，結合并抑制miR-137，促進其靶基因Rac1的表達[20]。另外，研究證實敲除Xist可上調miR-152，達到抑制膠質母細胞瘤干細胞的作用。

以上是一些經典的lncRNA-miRNA在膠質瘤中的作用機制。另外經實驗研究證實：與膠質瘤惡性程度正相關的lncRNA不僅促進膠質瘤的發生及其發展，并且與患者的不良愈后顯著相關，如：lncRNA-ATB通過抑制miR-200a進而促進TGR-β2的表達起作用；同源異形框轉錄反義基因間RNA(hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)作為miR-15b的ceRNA，通過HOTAIR-miR-15b-p53軸起作用，而miR-15b既可通過單獨抑制HOTAIR，又可通過促進p53基因的表達起作用[21]。

而另一些lncRNA抑制惡性膠質瘤細胞增殖，在惡性膠質瘤中的表達明顯低于正常大腦神經組織：癌癥易感性候選基因2(CASC2)、牛磺酸調節基因(Taurine Up-Regulated 1，TUG1)、lncRNA Cas5和lncRNA RP5-833A20.1等。CASC通過抑制miR-21的表達起作用。TUG1是miR-R26a的分子海綿，miR-R26a通過結合PTEN的3’UTR啟動TUG1-miR-R26a-PTEN軸抑制膠質瘤。但膠質瘤細胞因為需要營養物質，因此其血管生成受到調節，TUG1-miR-299通過調節VEGF促進膠質母細胞瘤的血管生成[22]。lncRNA Cas5通過抑制miR-222起作用。lncRNA RP5-833A20.1通過抑制NFIA的mRNA和蛋白水平以增強NFIA啟動子的甲基化，增加miR-382-5p的表達起作用。

5 小結與展望

膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，復發和死亡率均很高。膠質瘤患者5年平均生存率僅為20%，其最具生物侵襲性的多形性膠質母細胞瘤(GBM)，其患者的5年平均生存率<3%。即使進行了積極的手術、放化療，GBM患者的預后仍然很差，診斷后的中位OS只有12～15個月。目前GBM發生和發展的基因及其分子學機制尚不完全清楚，因此，在基因和分子水平上掌握膠質瘤的發生發展機制至關重要。充分了解并深入分析lncRNA-miRNA在膠質瘤早期發生及其發展過程中的作用機制有助于為膠質瘤患者的早期診斷和治療提供確切可靠的科學依據。