組織工程結膜支架的研究進展

唐浚杰，劉小勇，周 清，陳 劍

結膜重建常用于各種化學熱燒傷所導致的嚴重結膜缺損，而組織工程結膜能有效解決在結膜移植中自體結膜移植材料缺乏及異體結膜移植材料存在免疫排斥反應等難題。具有良好生物相容性及足夠生物力學強度的支架材料是構建組織工程結膜的重要條件。本文對組織工程結膜支架材料的最新研究進展及目前存在的問題進行總結。

0 引言

結膜是由眼瞼緣間部末端開始，覆蓋于眼瞼后和眼球前節鞏膜表面的一層半透明黏膜組織，組織學上由鱗狀上皮細胞、杯狀細胞及疏松結締組織組成。結膜直接與外界接觸，很容易受各種外傷損害，嚴重熱燒傷、化學燒傷以及嚴重的眼表疾病如眼瘢痕性類天皰瘡、Stevens-Johnson綜合征等，可導致結膜大面積受損，嚴重影響結膜上皮的分泌功能和眼表的完整性，造成廣泛粘連和瘢痕形成。瞼球粘連的治療需要手術移除瘢痕組織及重建深部穹窿，切除瘢痕組織后暴露的鞏膜需要覆蓋結膜組織。結膜重建手術最大的限制因素是，當患者雙眼均缺乏可提供移植的健康結膜組織時需要用到結膜組織代替物。為了解決結膜移植材料短缺及免疫排斥反應等難題，學者們開始把目光轉向組織工程結膜的研究。組織工程結膜主要由種子細胞、支架材料及調控微環境構建而成[1]。符合臨床需求的組織工程結膜的支架材料需要滿足以下條件：足夠的力學強度，良好的生物相容性。與組織工程角膜不同的是，組織工程結膜的支架材料并不需要透明的材料，從而大大增加了材料選擇的范圍。大量的研究已經嘗試把各種不同類型的支架材料運用到組織工程結膜中，其中主要包括生物材料支架、蛋白材料支架、聚合物材料支架及混合材料支架[2]。

1 生物材料支架

1.1羊膜 羊膜具有光滑，無血管、神經及淋巴，具有彈性，含有多種細胞因子及生長因子等特點。羊膜是目前臨床結膜重建最常用的結膜代替物，其優點包括促進上皮細胞修復、減少炎癥反應和瘢痕形成等[3]，而且Yang等[4]發現羊膜上皮細胞可被誘導分化成類結膜樣上皮細胞。實驗研究表明，普通羊膜或脫細胞羊膜均可用于結膜重建[5]。Jie等[6]選取新西蘭大白兔作為動物模型，使用脫細胞羊膜進行結膜重建術并以正常羊膜移植為對照，結果提示脫細胞羊膜可有效促進上皮細胞復層及杯狀細胞分化，并且有助于減少炎癥反應及瘢痕形成。羊膜移植目前在臨床上廣泛應用于眼表重建，但是羊膜移植仍然存在著不足之處：(1)羊膜移植片在炎癥浸潤的環境中會快速降解從而降低了上皮再生的成功率，這限制了羊膜移植在眼化學傷、燒傷等嚴重的炎癥環境中的使用；(2)羊膜供體的個體差異使羊膜移植片的厚度與質量存在差異，同時存在著傳染病感染的風險。 羊膜移植的缺點使其適用范圍受到限制，進而促使研究者把目光投向新型支架材料用于眼表重建。

1.2脫細胞基質 脫細胞基質是指通過化學法、表面活性劑法、蛋白酶法等去除細胞、DNA以及抗原的三維結構組織[7]。脫細胞基質支架最大的優點是其擁有組織特異性的生物力學強度與生物相容性，同時它能直接還原細胞生長的三維環境，從而促進細胞遷移、增殖與分化。多項動物實驗表明，脫細胞結膜相比羊膜有以下優點：更好的愈合效果，更好的眼表力學穩定性[7-8]。Witt等[9]選取人脫細胞結膜及豬脫細胞結膜進行動物實驗并與羊膜進行對比，結果顯示脫細胞結膜更有利于傷口愈合而且力學穩定性更佳，但是免疫細胞的浸潤在脫細胞結膜組及羊膜組基本無差異。脫細胞的豬結膜來源廣泛而且脫細胞豬結膜在各項生物性能上與人脫細胞結膜基本相近[9]，所以從倫理及經濟效益角度上考慮，豬脫細胞結膜在結膜重建中是更好的選擇。脫細胞牛心包組織作為可降解生物補片已經在臨床上應用于泌尿系重建、乳房切除術后重建等[10-11]。Huang等[12]嘗試使用脫細胞牛心包組織在動物模型上進行結膜重建，結果顯示結膜上皮細胞能在脫細胞牛心包補片上有效生長，脫細胞牛心包補片移植組的恢復速度更快，心包組織中含有的肌源性成纖維細胞亦有助于膠原結構的重建，但是由于結膜Tenon囊與鞏膜間有一層較厚的膠原組織限制了營養物質的輸送，脫細胞牛心包基質無法有效構建上皮細胞復層，在一定程度上限制了其在眼表重建中的臨床應用。脫細胞基質是近年組織工程研究的熱點，其優點表現在：(1)材料來源廣泛，研究者可利用非眼表脫細胞組織進行眼表重建，如心包組織及羊膜等，意味著更多的脫細胞組織有望用于眼表重建。(2)脫細胞基質高度還原細胞生長骨架，表現出較好的生物相容性，有利于細胞的增殖及分化。(3)制備方法簡單高效。但是天然基質中所含的各類可溶性生長因子成分在脫細胞過程中難以保留。結合其優缺點，脫細胞基質作為支架材料用于眼表重建的前景十分廣闊。

2 蛋白材料支架

2.1膠原蛋白 結膜的基底膜由Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白-1、巢蛋白-2以及血小板反應蛋白-4組成[13]，該理論為組織工程結膜的支架材料提供了新的選擇。其中關于Ⅰ型膠原蛋白的研究較多，但是單純的膠原蛋白的孔狀結構呈隨機排列，使其缺乏彈性從而導致支架缺乏足夠的力學強度[14]。部分學者開始嘗試用改良復合型膠原蛋白制作支架，如塑化壓縮型膠原(plastic compressed collagen，PCC)及膠原vitrigel膜(collagen vitrigel, CV)。Drechsler 等[15]通過體外實驗發現人結膜上皮細胞能在PCC上有效增殖、分化， Witt等[16]使用PCC在結膜缺損兔模型上進行結膜重建，結果顯示PCC移植片上能有效形成上皮復層及杯狀細胞表達，而且無瘢痕形成，在動物實驗中PCC表現出足夠的力學強度與彈性，而且手術操作性良好。CV屬于Ⅰ型膠原膜，它的制作過程分為三步：凝膠化、玻璃化、脫水。CV的力學及光學性質可由玻璃化過程的時間、溫度及濕度控制。Zhou等[17]成功使用CV作為結膜替代物用于結膜重建，它的優點包括：足夠的彈性、透明、生物相容性佳、方便手術操作等。隨著技術的改進，復合型膠原蛋白支架填補了原來單純的膠原蛋白支架的缺點，目前PCC用于眼表重建已經完成體外及動物體內的研究，其力學強度及生物相容性滿足臨床需求，且無感染風險，后續研究可關注其運用于臨床實踐中的效果。

2.2纖維蛋白 纖維蛋白主要來源于血漿蛋白，因此具有明顯的血液和組織相容性。它的主要生理功能為止血，另外還可促進創傷的愈合。纖維蛋白還可作為一種骨架，促進細胞的生長，并具有一定的殺菌作用。纖維蛋白作為組織工程支架材料已廣泛應用于各種組織，如骨、心臟、神經、皮膚、角膜等[18]。Safinaz等[19]利用自體纖維蛋白制作組織工程結膜支架，動物實驗結果顯示自體纖維蛋白支架與羊膜移植效果接近。自體纖維蛋白支架的優點在于材料獲取容易、高效和生物相容性佳，而且其降解速率可由抗蛋白酶肽控制。目前纖維蛋白支架應用于組織工程結膜的實驗研究數量較少，臨床應用效果有待觀察。

3 聚合物材料支架

聚合物支架材料包括乙醇酸、乳酸、6-己內酯、1,3-碳酸三甲烯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸等。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和聚己內酯(PCL)已通過美國食品藥品監督管理局審核可應用于人體。聚合物支架的優點有：生物降解率可以由聚合物組成成分進行調控，嚴格無菌的制作過程可避免傳染病感染的風險，良好的力學強度。Ang等[20]使用超薄PCL進行兔眼結膜重建，實驗結果顯示超薄PCL膜有足夠的力學強度，易于手術操作。結膜上皮細胞能在氫氧化鈉處理后的超薄PCL膜上有效附著、增殖、復層，杯狀細胞在超薄PCL膜上亦有增殖、分化。He等[21]對多種聚合物支架進行比較發現杯狀細胞僅能在部分聚合物支架中有效表達，而杯狀細胞在移植片上的有效增殖分化意味著更高的臨床應用價值，因為重建的結膜若缺乏杯狀細胞將難以構成穩定的淚膜。Huhtala等[22]在聚乳酸材料上培養人角膜上皮細胞、兔結膜基質成纖維細胞、牛角膜內皮細胞、人結膜上皮細胞等，檢測聚乳酸材料的細胞毒性及生物相容性，結果顯示聚乳酸材料擁有可靠的生物相容性。Campillo-Fernandez等[23]運用多種聚合物材料培養結膜上皮細胞，結果顯示丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸聚合物能讓結膜上皮細胞更好地增殖、分化。

聚合物材料支架的研究深入，而且通過了大量的安全監測，具有較高的臨床應用價值，但是僅有少量聚合物材料能同時滿足高力學強度、良好的生物相容性等條件。雖然聚合物材料現已應用于臨床，但是該類材料造價昂貴，難以在臨床上廣泛普及。

4 混合材料支架

4.1電紡技術 電子紡織技術可以通過編制納米纖維制作類似細胞外基質結構的支架。獨特的納米纖維結構可以協助細胞増殖及分化，并且能夠讓支架與外周環境有效交換營養物質與代謝產物[24-25]。Barati等[26]使用天然絲蛋白與合成左旋聚乳酸(PLLA)進行電紡編織構建支架，并在其表面成功誘導結膜間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞(insulin producing cells, IPCs)，證明電紡技術所構建的混合材料支架同樣具有良好的生物相容性。Yao等[27-28]利用電子紡織技術對聚合物支架進行改良，分別使用膠原蛋白、纖維蛋白與PLGA進行電紡編織，這類支架結合了聚合物材料支架與蛋白材料支架的優點，生物相容性佳，高力學強度，而且結膜上皮細胞能在其表面生長增殖，同時不產生明顯炎癥反應，該類支架的降解產物為氨基酸、乳酸及己酸，均可代謝且無細胞毒性。總結電紡技術用于眼表重建的優點：(1)精準編織及改良空間結構以滿足細胞生長需求。(2)材料來源廣泛且組合選擇豐富。因此，電紡技術編織混合材料制作支架的概念可進一步發展，嘗試不同材料聯合構建的效果以完善支架性質。

4.2 3D打印技術 3D打印技術采用逐層打印的方法，從微觀到宏觀進行結構制作，能有效構建有利于組織形成和促進宿主組織整合的仿生結構環境，因此3D打印技術能運用在組織工程支架的制造當中。Dehghani等[29]以凝膠、彈性蛋白及透明質酸為材料，利用3D打印技術制作組織工程結膜支架，動物實驗結果顯示該支架便于手術操作，細胞在其表面能有效粘附、增殖及分化，抗炎效果佳，降解周期長。該實驗中使用的凝膠是膠原來源的一種蛋白，它能模仿結膜基底膜中Ⅳ型膠原蛋白的結構，彈性蛋白與透明質酸的添加減少了免疫抗原成分并還原了細胞生長的生理環境。3D打印技術的優點與電紡技術的優點接近，均可對支架微觀結構進行改造以滿足生物力學強度，同時可利用多種生物材料用于構建骨架以滿足生物相容性。期待在未來的研究中，該類新型材料制造技術可以脫細胞基質為模板進行快速復制以高效還原天然基質結構用于眼表重建。

5 總結與展望

綜上所述，符合臨床需求的組織工程結膜支架需滿足以下條件：良好的生物相容性，足夠的生物力學強度。臨床上傳統使用的羊膜作為支架進行結膜重建，面臨著降解速率快、細胞分化率低等問題難以解決。聚合物材料支架正在逐步進入臨床使用，但是普及度較低。新型蛋白質材料支架以CV、PCC為代表，經過化工處理后表現出優良性質，可期待該類支架的進一步進展。3D打印技術與電紡技術等高新技術應用于組織工程具有巨大前景，它們可以利用多種不同來源的材料對模型進行快速構建。脫細胞基質保留了細胞生長原始環境，是當前各項技術追求還原的結構，而且脫細胞基質材料來源廣泛，制備過程快捷方便，是目前組織工程結膜支架的熱門研究方向。