眼表糖萼屏障及其在干眼中的應用

黎 彪，師藝丹，邵 毅

研究表明，眼球表面上皮細胞中高度糖基化的黏蛋白和半乳糖凝集素-3共同形成的糖萼屏障對眼球表面濕潤性和潤滑性的維持十分重要。而干眼患者眼球表面濕潤性降低及淚膜破裂時間縮短與糖萼屏障的損傷密切相關。本文旨在概述眼球表面糖萼屏障的組成及其在干眼中的變化，介紹評估干眼患者糖萼屏障損傷的新方法，并對目前使用的兩種靶向治療干眼患者眼球表面糖萼屏障損傷的藥物進行綜述。

0 引言

眼球表面上皮細胞中有大量高度糖基化的糖蛋白構成的糖萼屏障，其主要組分為跨膜黏蛋白MUC1、MUC4、MUC16和半乳糖凝集素-3，在眼球表面起到潤滑、濕潤、屏障作用。干眼患者眼表的糖萼會發生病理性變化，主要表現為糖萼中跨膜黏蛋白的表達水平降低和糖基化水平提高。這些病理性變化將會導致正常情況下穩定結合在糖萼上的半乳糖凝集素-3釋放到淚液中，因此可以通過檢測淚液中半乳糖凝集素-3的含量評估糖萼屏障的損傷程度。目前靶向治療干眼發生發展過程中跨膜黏蛋白表達不足的眼科藥物主要有地夸磷索鈉滴眼液和瑞巴派特眼用混懸液。

1 眼球表面的糖萼屏障及其主要組成成分

眼球表面上皮細胞的頂層膜上有突出于眼球表面的微皺褶，可以增加大多數淺層上皮細胞的表面積[1]。微皺褶上的糖萼是上皮細胞和淚膜間的邊界[2]，可以延伸到眼球表面上皮細胞質膜500nm以外的區域，主要由糖蛋白[3]和膜連結黏蛋白[4]組成，糖蛋白起骨架作用[5]，而膜連接黏蛋白則在上皮細胞表面起到潤滑、濕潤以及屏障作用。

黏蛋白是分子量最大、糖基化程度最高的糖蛋白，由至少120種不同的糖蛋白組成且具有兩個特征[6]：(1)黏蛋白的胞外區由多種串聯重復的氨基酸組成且富含絲氨酸和蘇氨酸，這些串聯重復的氨基酸胞外區為N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通過O-糖基化與多種半乳糖連接提供連接位點[5]；(2)黏蛋白分子中O-糖基化分子量約占總分子量的50%～80%，大量的O-糖基化有助于黏蛋白形成親水性負電荷[7]。

層狀結膜和角膜上皮細胞表達4種黏蛋白，即MUC1[8]、MUC4[9]、MUC16[5]、MUC20[10]。由于編碼蛋白質骨架的串聯重復序列的基因具有多態性，不同個體間的黏蛋白分子量有很大的差別。眼球表面三種主要黏蛋白為MUC1(120～300kDa)、MUC4(900kDa)、MUC16(20MDa)。其中MUC1和MUC16都集中分布在微皺褶尖端，并且在上皮細胞-淚液層交界處形成密集的糖萼[11]。MUC1最早在乳腺癌細胞表面分離得到，并且是第一個被克隆和分析的黏蛋白[12]。MUC4蛋白及其mRNA主要分布在結膜上皮細胞中，幾乎不表達于角膜中心上皮細胞[9]。由于玫瑰紅染料可以使糖萼屏障損傷的細胞被染色，因此可以用該染色法來評估干眼(dry eye disease，DED)患者的眼球表面損傷程度。將MUC16中的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)基因敲除后導致玫瑰紅染料對培養得到的角膜上皮細胞染色能力增強，揭示了MUC16在抗玫瑰紅染料染色中的直接作用[13]。而MUC20雖然在人類結膜和角膜的上皮細胞中高度表達[14]，但其在眼球表面的功能尚未明確。

高度糖基化的跨膜黏蛋白需要與半乳糖凝集素-3相互作用才能形成眼球表面的糖萼屏障。半乳糖凝集素-3是人體正常結膜中表達程度最高的糖蛋白，分子量為35kDa，最初只被鑒定為一種嵌合型的半乳糖凝集素。半乳糖凝集素-3的N端可以形成五聚體，從而進一步形成寡聚體，有助于半乳糖凝集素-3的晶格交聯，形成多種幾何構型[15]。交聯分子包括表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)受體和a5b1整合蛋白[16]。在頂端糖萼中，半乳糖凝集素-3可以同時定位膜連接MUC1和MUC16，這兩種黏蛋白都可以以半乳糖依賴的方式結合到半乳糖凝集素-3親和柱上[17]。在半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中以及使用siRNA阻斷半乳糖凝集素-3在人層狀角膜上皮細胞中的生物合成時可以觀察到角膜糖萼屏障功能出現明顯損傷[18]。綜上，半乳糖凝集素-3在維持眼球表面上皮細胞頂端跨膜黏蛋白之間通過糖依賴型相互作用形成的黏膜屏障功能中起到關鍵的作用。

2 糖萼在眼球表面的作用

糖萼屏障中跨膜黏蛋白的主要作用為：(1)通過對眼球邊緣的潤滑作用減少摩擦損傷，保護眼球表面；(2)在頂端細胞表面形成糖萼屏障，阻止變應原、病原微生物以及其它細胞外小分子的入侵；(3)通過大量的O-連接糖基化將疏水質膜轉化為親水質膜，以此提高上皮細胞的潤滑性[5, 8]。致密的黏蛋白聚合網同時也具有很高的水合能力，可能可以抑制淚液蒸發[19]。目前直接描述MUC1在眼球表面功能的資料并不多。離體研究表明，MUC1起到抗黏附分子[20-21]、信號分子[22]和病原體屏障的作用[23-24]。一般來說，MUC4通過激活MUC4-β EGF區域的酪氨酸激酶ErbB2受體參與信號轉導[25]。MUC16作為糖萼組分參與保護性表面的形成，從而參與形成病原體和分子屏障。有研究對MUC1和MUC16的屏障作用進行了比較。敲除MUC16的角膜上皮細胞所有屏障功能(包括抵御染料染色、細菌附著和入侵的保護作用，跨上皮細胞的阻礙和緊密連接的形成)均減弱。相反，敲除了MUC1的細胞對染料染色和細菌侵入的抵抗均顯著增強[4]。因此，相較于其它眼球表面膜結合黏蛋白，MUC16在糖萼屏障的形成中可能發揮著更為重要的作用。

半乳糖凝集素家族屬于具有保守糖基識別域(carbohydrate recognition domain，CRD)的可溶性凝集素并結合有含β-半乳糖苷的聚糖[26-27]。半乳糖凝集素被認為可以調節多種生物學過程，并且可以參與對細胞活化、細胞黏附、細胞分化、細胞因子的分泌、炎癥反應、創傷修復、原生質組成等的調控[28-29]。

角膜和結膜表面的上皮細胞中均具有跨膜屏障和細胞旁路屏障。跨膜屏障主要以膜連結黏蛋白、半乳糖凝集素-3組成的上皮細胞糖萼形式存在[30]，因此眼球表面的糖萼具有明顯的屏障功能。總體而言，眼球表面大量的糖萼糖蛋白有助于保護細胞抵御機械和化學損傷，防止病原體滲透入眼，減少眨眼時的摩擦損傷和維持眼球表面的親水性[3]。此外，糖萼廣泛分布在人體不同組織細胞中，具有多種功能。如內皮細胞表面糖萼的完整性可以一定程度減少膿毒血癥損傷[31]；糖萼可以作為腎小球濾過膜的有效成分，維持濾過膜功能的完整性[32]；血管內皮細胞糖萼可以保護血管內皮細胞和維持血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)完整性，血管內皮細胞糖萼的損傷可能是系統性炎癥向中樞性炎癥遷移的重要始動環節[33]。

3 干眼患者黏蛋白表達的變化

一項免疫組織化學研究通過檢測H185抗體發現，干眼患者眼球表面跨膜黏蛋白的表達水平和糖基化水平均會發生改變。H185抗體可以識別MUC16糖類抗原決定簇而不識別MUC1抗原決定簇[5]。結膜細胞的H185抗體鑲嵌結合模式可以與細胞發生輕微、中等或強烈的結合。在非干燥綜合征型干眼患者眼睛上，H185的鑲嵌結合模式喪失并被“‘星空’模式”(缺少尖端細胞連接呈“黑夜狀”，杯狀細胞連接增長呈“星空狀”)所取代[34]。

眼球表面發生病變則黏蛋白的糖基化也會發生改變。使用印跡細胞學進行評估發現，隱形眼鏡配戴者、干眼患者、使用β-受體阻斷劑治療的青光眼患者結膜中的唾液酸酸化黏蛋白鏈均減少。通過將糖殘基轉化為核蛋白可以實現乙二醇鏈的引發和延伸，糖基轉移酶在該過程中起到重要的催化作用。

GalNAc翻譯后蛋白質骨架上絲氨酸和蘇氨酸殘基的增加是通過N-乙酰半乳糖胺糖基轉移酶(GalNAc transferases，GalNAc-Ts)形成O-連接聚糖的初始轉移步驟。患有早期眼瘢痕性類天皰瘡(ocular cicatricial pemphigoid，OCP)的患者GalNAc-Ts的分布會增加[35]。這提示通過合成黏蛋白O-連接聚糖以維持尖端上皮細胞表面的濕潤可以補償眼球表面上皮細胞。但是，在眼瘢痕性類天皰瘡晚期患者和角質化上皮細胞上皮表面并不能通過免疫組織化學分析法檢測出GalNAc-Ts[35]。由此，上述證據表明干眼患者眼球上跨膜黏蛋白的表達水平和糖基化水平均發生變化。非干燥綜合征型干眼患者結膜的黏膜上皮細胞細胞膜中黏蛋白表達水平和MUC1的免疫反應均減少。另外，對結膜的印跡細胞學檢測結果顯示，相對于正常人來說，非干燥綜合征型干眼患者的MUC1、MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC7基因的表達量顯著下降[36]。此外，干眼患者眼球表面水溶液的缺乏或淚膜破裂時間(break-up time，BUT)較短都會導致淚膜不穩定，與正常個體相比結膜中MUC5AC和MUC16的mRNA表達水平下降[37]。在輕度至中度干眼中可以觀察到MUC1唾液酸含量增加，而在重度干眼中其含量則會減少[38]。另一項研究發現，干燥綜合征型干眼患者與正常人相比mRNA表達水平和MUC16、MUC1的含量均顯著增加。這一爭議性的結果目前并沒有得到很好的解釋。而在患有非干燥綜合征型干眼的絕經期女性中，MUC1和MUC16的mRNA和(或)蛋白質的表達均顯著高于正常水平，該現象可能歸因于眼球表面的刺激性和與早期干眼相關的炎癥反應[39]。

4 眼球表面濕潤性降低和糖萼屏障破壞的評定

邵毅[40]指出對疑似干眼的患者，進行DED問卷-5(dry eye disease eye questionnaire-5，DEQ-5)或眼表疾病指數(ocular surface disease index，OSDI)調查以評估患者是否患有干眼，非侵入性的淚膜破裂時間減少、淚膜滲透壓升高或雙眼差異較大、任一眼(角膜、結膜或眼瞼邊緣)表面染色，三項體征出現任何一個均提示眼內平衡受到了破壞。臨床實際中淚液高滲透壓的評估方法準確度和敏感度有待提高，且上述方法只能初步判斷干眼是否存在，而不能確定干眼的發展進程。徐婷婷等[41]指出淚液作為淚腺分泌的水樣液體，其含有的數千種蛋白質和其他分子成分含量的改變，在眼病的發生和發展中具有重要作用。由此提示，可以根據干眼患者淚液成分的變化評定干眼的程度。

大量膜連接黏蛋白聚糖可以識別上皮細胞釋放的半乳糖凝集素-3的糖基識別域從而與其結合，而后半乳糖凝集素-3低聚物將作為跨膜黏蛋白之間的橋梁，形成半乳糖凝集素的晶格[17]。糖萼屏障可以形成非常厚的絕緣層來保護眼球表面不受環境中有害因素的影響，從而達到保護細胞表面的目的。

干眼會改變黏蛋白的糖基化程度[3, 34]并且下調葡萄糖糖基轉移酶蛋白的表達水平，隨后聚糖的延伸率也會降低[35]。這些病理條件將導致膜連結黏蛋白質和量的下降以及聚糖不能夠捕獲眼球淺表面上皮細胞分泌的所有半乳糖凝集素-3。因此，患有干眼時，半乳糖凝集素-3將不會停留在糖萼中，而是會進入到淚液中[42]。一項有限群組的非定量免疫印跡研究發現，健康受試者(n=4)的淚液中不含有半乳糖凝集素-3，但在多種眼球表面異常(包括大泡性角膜病變、結節病、慢性瞼緣炎、中毒性結膜炎、腺病毒性結膜炎、堿燒傷)情況下，受試者(n=9)的淚液中會含有半乳糖凝集素-3[43]。此外，相對于正常受試者來說，干眼患者的淚液中半乳糖凝集素-3含量更高[42]，且該項研究表明淚液中半乳糖凝集素-3的含量與BUT呈負相關關系，分析可能是由眼球表面糖萼破損導致的。跨膜黏蛋白形成聚糖聚合物是維持眼球表面濕潤性的必要條件。干眼患者聚糖聚合物的合成受到抑制，導致糖萼的持水能力降低，從而導致BUT縮短。必然地，糖萼的破損會降低眼球表面的潤滑性，使更多的半乳糖凝集素-3釋放到淚膜中。此外，半乳糖凝集素-3的N端延伸部分可以被金屬蛋白酶水解而形成半乳糖凝集素-3單體，該單體將干擾半乳糖凝集素-3依賴性聚合反應的進行[15, 44]。研究表明，干眼中基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)的活性明顯增強[45-46]，且干眼患者淚液中半乳糖凝集素-3C與半乳糖凝集素-3的比值上升[46]。淚液樣本中半乳糖凝集素-3的分裂可以被廣譜的蛋白酶抑制劑Cocktail所破壞，但跨亞型的基質金屬蛋白酶抑制劑無破壞作用。這項結果表明除基質金屬蛋白酶類的蛋白酶均可促進干眼患者淚液中半乳糖凝集素-3降解[42]。研究表明，患有嚴重眼球表面疾病的患者淚液中含有中性粒細胞彈性蛋白酶，該酶是黏蛋白的有效水解酶[47-48]。上述研究結果表明，半乳糖凝集素-3有希望作為一種生物標志物，用于對眼球表面存在病理性變化的患者進行評估。

5 靶向治療跨膜黏蛋白減少的眼科藥物

5.1地夸磷索鈉滴眼液 地夸磷索是一種嘌呤能P2Y2受體激動劑，可以刺激結膜上皮細胞中水的分泌以及促進結膜杯狀細胞中黏蛋白的分泌[42]。使用裂隙燈熒光光度測定法進行測量時，熒光染料在實驗性干眼的大鼠角膜中央滲透率高于正常大鼠。但使用3%地夸磷索治療1wk后，角膜滲透率明顯降低[49]。上述結果表明地夸磷索能夠提高淚液分泌量并修復角膜上皮細胞的屏障功能。此外，將SV40永生化人類角膜上皮細胞暴露于地夸磷索焦磷酸中3h，將導致膜連結黏蛋白(MUC1、MUC4、MUC16)基因表達水平提高，并有劑量依賴關系。地夸磷索滴眼液在臨床治療上也取得了良好的效果。一項Ⅲ期臨床研究發現，使用3%地夸磷索滴眼液或透明質酸鈉滴眼液(對照組)對干眼受試者治療4wk，使用熒光染料和玫瑰紅染料進行角膜中央染色評分，接受地夸磷索治療的受試者得分明顯高于對照組。

5.2瑞巴派特眼用混懸液 瑞巴派特(商品名為Mucosta眼用混懸液)是2-(1H)-喹啉酮的氨基酸衍生物，靶向治療干眼中黏蛋白的缺乏。該藥物最初作為黏膜保護劑，在十二指腸潰瘍和胃炎痊愈后使用。瑞巴派特可以增強粘液中糖蛋白的合成，具有刺激前列腺素和抑制活性氧的作用，同時還可以暫時性激活編碼環氧合酶-2和生長因子(包括EFG及其受體)的基因[50]。研究表明，前列腺素缺乏會導致潰瘍愈合緩慢且復發風險增高，因此非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)可以促進胃潰瘍瘢痕組織中炎癥細胞的滲透擴散[50-51]。選取身體健康狀況良好的志愿者進行的隨機對照安慰劑臨床試驗表明，瑞巴派特可以避免非甾體類抗炎藥導致的胃黏膜損傷。另一組隨機試驗表明，白內障術后聯合使用瑞巴派特和局部非甾體類抗炎藥具有良好的效果，尤其對緩解術后并發的伴隨有結膜杯狀細胞減少的干眼效果明顯[52]。此外，一項Ⅲ期臨床試驗比較了2%瑞巴派特眼用混懸液和0.1%透明質酸鈉眼用混懸液對干眼的治療效果，使用瑞巴派特前后在麗絲胺綠對結膜的染色評分中變化不大，但BUT明顯延長并伴隨眼球表面條件和濕潤性改善[53]。同時，瑞巴派特組受試者的異物感、眼睛疼痛感、糖萼屏障破損相關干眼癥狀也得到了改善。

實驗室條件下用瑞巴派特對單層人角膜上皮細胞處理2h后，MUC1、MUC4、MUC16基因的體外表達增加；處理24h后，瑞巴派特通過活化EGF受體，增加了MUC1、MUC4、MUC16蛋白質表達水平[54]。此外，在用人角膜上皮細胞分層培養模擬人體角膜上皮細胞實驗中，瑞巴派特可以增加MUC16的表達水平，但對MUC1、MUC4、MUC20無明顯的增加作用[55]。上述結果表明，瑞巴派特可能是通過矯正MUC16蛋白的表達來修復干眼中糖萼屏障的損傷。

6 研究前景

干眼是一種多發于老年人的眼科疾病，患者多自覺眼部干澀，有異物感、灼燒感等[56]。干眼的發病機制比較復雜，與神經病理疼痛多有相似之處[57]。心理因素對干眼的進展也有重要的影響，在治療過程中應當予以重視。目前對干眼的檢查主要通過淚膜干涉測量、光學相干斷層造影、瞼板腺成像等技術進行[58]，糖萼屏障損傷導致患者淚液中病理性出現半乳糖凝集素-3為干眼的診療提供了新的思路。

地夸磷索和瑞巴派特均有助于恢復干眼患者眼睛糖萼屏障的穩定性。地跨磷索在日本、韓國、越南、泰國、中國等亞洲國家已被批準用于臨床治療。然而，瑞巴派特僅在日本被批準上市。現有的干眼治療方法的研究為“干眼如何使糖萼屏障損傷”的問題提供了一些思路，但尚不能很好地解釋其發生發展的機制。今后關于干眼中眼球表面黏蛋白質和量變化檢測的研究，需要加深對糖萼屏障破壞和修復機制的探討，并且需要類似于蛋白質組學分析與遺傳學等先進技術的支持。