苯酚脅迫下多刺裸腹溞實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選

王 茜 劉文秀 高 菲 王 蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006)

枝角類是生態(tài)毒理學(xué)中常用的化學(xué)物質(zhì)生態(tài)毒性評(píng)價(jià)模型之一[1]。多刺裸腹溞(Moina macrocopa)作為常見(jiàn)的枝角類, 是除大型溞(Daphnia magna)和蚤狀溞(Daphnia pulex)之外的又一理想材料, 是山西省水體中的優(yōu)勢(shì)物種, 全身透明、繁殖率高、對(duì)農(nóng)藥等化學(xué)品具有高的敏感性[2], 常被用于水環(huán)境的生物監(jiān)測(cè)。目前關(guān)于多刺裸腹溞分子生物學(xué)方面的研究較少, 相關(guān)分子生物學(xué)信息匱乏,限制了外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)其毒性效應(yīng)的分子機(jī)制的研究。

實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)是在傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的核酸定量技術(shù)[3], 操作快速靈敏、具有特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、檢驗(yàn)范圍廣等特點(diǎn), 隨著技術(shù)的不斷成熟, 廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[4]。qRT-PCR主要有絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)煞N方法, 其中相對(duì)定量不需要已知的標(biāo)準(zhǔn)品, 相對(duì)簡(jiǎn)便因而被大量采用[5], 但前提是需要穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

內(nèi)參基因是指在對(duì)某一個(gè)目的基因進(jìn)行定量研究時(shí), 在實(shí)驗(yàn)條件下待測(cè)樣品中表達(dá)相對(duì)恒定的一類基因, 其作用是校正目的基因的定量過(guò)程[6]。常用的內(nèi)參基因大多是管家基因(House-keeping gene), 包括編碼組蛋白基因、線粒體蛋白基因、編碼核糖體蛋白基因、生物代謝途徑中各種關(guān)鍵酶的基因等, 如rRNA、β-actin、cyclophilin、hsp、gapdh、rpl13等[7]。這些管家基因大多參與了生物體基本代謝活動(dòng), 因而具有穩(wěn)定表達(dá)的特性[8]。但內(nèi)參基因并非在所有生理?xiàng)l件下都能穩(wěn)定表達(dá), 在特定實(shí)驗(yàn)條件或某些組織細(xì)胞中各基因的表達(dá)穩(wěn)定性有差異[9], 至今還未發(fā)現(xiàn)一個(gè)適合所有條件下基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因[10]。……