火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC指紋圖譜

陳錦霞，曾杉，林碧珊，陳偉鋼，呂豪輝

國(guó)藥集團(tuán) 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 順德 528303

火麻仁為桑科植物大麻CannabissativaL.的干燥成熟果實(shí)[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，性平，味甘。其具有潤(rùn)腸通便的作用，多用于血虛津虧、腸燥便秘。近代藥理研究表明，火麻仁還具有殺蟲、抗炎、抗血栓形成、抗心律失常、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗?jié)兊茸饔茫幸欢ǖ亩拘裕R床常用于治療便秘、術(shù)后胃腸功能恢復(fù)、神經(jīng)性皮炎、高血壓等[2-6]。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎液。火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑由火麻仁藥材經(jīng)炮制、提取、過(guò)濾、濃縮、干燥制備而成。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)建立了火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的水溶性指紋圖譜和脂溶性成分指紋圖譜，為制定火麻仁配方顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H dass型超高效液相色譜儀(沃特世公司)；MS105DU型十萬(wàn)分之一天平、萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)；YMW型機(jī)械分體煎藥壺(深圳一枚王有限公司)。

1.2 試藥

火麻仁對(duì)照藥材(批號(hào)：121097-201605)、對(duì)照品α-亞麻酸(批號(hào)：111631-201605，純度：99.8%)、亞油酸(批號(hào)：111622-201203，純度：99.8%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；磷酸、甲酸、乙腈、甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。

參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版火麻仁項(xiàng)下炮制方法制成火麻仁飲片[1]，藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定，為桑科植物大麻CannabissatiraL.的干燥果實(shí)，具體信息見(jiàn)表1。

表1 火麻仁藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

以國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》為依據(jù)，制備火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取火麻仁飲片100 g，置于砂鍋中，加水煎煮2次。第一次煎煮加8倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁熱過(guò)200目篩濾過(guò)，濾液迅速冷卻，備用；第二次煎煮加飲片量6倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁熱過(guò)200目篩濾過(guò)，濾液迅速冷卻。合并2次濾液，65 ℃減壓濃縮，濃縮至約200 g，冷凍干燥，即得。20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品編號(hào)為S1～S20。

2.2 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ

2.2.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的CORTECS T3色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～5 min，0%A；5～15 min，0%～14%A；15～20 min，14%～90%A；20～20.1 min，90%～0%A)；流速為0.20 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30 ℃。

2.2.2參照物溶液的制備 取火麻仁對(duì)照藥材約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流 60 min，放冷，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，5000 r·min-1離心5 min(離心半徑為30 mm)，濾過(guò)，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇水10 mL，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理30 min，取出，放冷，用10%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4方法學(xué)考察

2.2.4.1精密度試驗(yàn) 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S13)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。分別計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(S13)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣。計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(S13)，分別精密稱取6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD均少于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ的建立

2.2.5.120批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ的測(cè)定 分別精密吸取2.2.3項(xiàng)下制備的各批次供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ疊加圖

2.2.5.2火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分對(duì)照指紋圖譜Ⅰ的建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)對(duì)20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ進(jìn)行相似度分析，見(jiàn)圖2。以3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，見(jiàn)表2～3。結(jié)果表明，20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分對(duì)照指紋圖譜Ⅰ相似度較好(>0.9)。

圖2 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ

表2 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ相對(duì)保留時(shí)間

表3 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ相對(duì)峰面積

2.3 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ

2.3.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～5 min，0%～25%A；5～10 min，25%～70%A；10～18 min，70%～100%A；18～21 min，100%A；21～21.1 min，100%～0%A)；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm。

2.3.2參照物溶液的制備 取火麻仁對(duì)照藥材約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水10 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流 60 min，取出，放冷，濾過(guò)，濾液置水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。另取對(duì)照品α-亞麻酸、亞油酸適量，精密稱定，加甲醇制成10 μg·mL-1的混合對(duì)照溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.4方法學(xué)考察

2.3.4.1精密度試驗(yàn) 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S11)，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。分別計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S11)，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、6、8、12、20、24 h進(jìn)樣。計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(S11)，分別精密稱取6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其RSD均少于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ的建立

2.3.5.120批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ的測(cè)定 分別精密吸取2.3.3項(xiàng)下制備的各批次供試品溶液1 μL，注入液相色譜儀，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性指紋圖譜Ⅱ疊加圖

2.3.5.2火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分對(duì)照指紋圖譜Ⅱ的建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)對(duì)20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分UPLC圖譜進(jìn)行處理，自動(dòng)校正后進(jìn)行色譜法匹配，匹配結(jié)果見(jiàn)圖4。以4號(hào)峰亞油酸為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，見(jiàn)表4～5。20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度較好(>0.9)。

注：3.α-亞麻酸；4(S).亞油酸。圖4 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性對(duì)照指紋圖譜Ⅱ

表4 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ相對(duì)保留時(shí)間

表5 20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ相對(duì)峰面積

3 討論

3.1 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜Ⅰ

3.1.1色譜條件的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器(PAD)對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，通過(guò)對(duì)比不同檢測(cè)波長(zhǎng)色譜圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm時(shí)，火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分色譜峰最多，且各色譜峰的響應(yīng)值均較高，因此選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。另考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水3種流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明，在乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好。以峰3為參照峰，20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分指紋圖譜的其余5個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.7%～0.9%，均小于3.0%。

3.1.2水溶性指紋圖譜Ⅰ的評(píng)價(jià) 本研究標(biāo)示了火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分的6個(gè)共有峰，并通過(guò)相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算出20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果均大于0.90。各批次火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性成分的圖譜整體上基本一致。

3.2 火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜Ⅱ

3.2.1色譜條件的選擇 火麻仁油脂類成分如亞油酸、α-亞麻酸等成分分子結(jié)構(gòu)中僅含有非共軛雙鍵，因此只有末端吸收，在205 nm附近具有較強(qiáng)吸收，因此選擇205 nm作為火麻仁脂溶性指紋圖譜Ⅱ的檢測(cè)波長(zhǎng)。另考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-水3種流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果在乙腈-水梯度洗脫下，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度良好。以峰4亞油酸為參照峰，20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分指紋圖譜的其余3個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.2%～0.8%，均小于2.0%。

3.2.2脂溶性指紋圖譜Ⅱ的評(píng)價(jià) 本研究標(biāo)示了火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分的4個(gè)共有峰，并通過(guò)相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算出20批火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果均大于0.90。各批次火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑脂溶性成分的圖譜整體上基本一致。

上述研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地火麻仁標(biāo)準(zhǔn)湯劑水溶性及脂溶性成分指紋圖譜相似度均較高，說(shuō)明不同產(chǎn)地火麻仁藥材質(zhì)量差異較小；研究建立的方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性高，為評(píng)價(jià)火麻仁藥材質(zhì)量提供了新的方法，并為制定火麻仁配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。