基于網絡藥理學的小承氣湯治療功能性便秘作用機制研究△

阮慶婷，張羽，黃美禎，潘春曲，謝勝

1.廣西中醫藥大學 研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學 第一附屬醫院，廣西 南寧 530000

功能性便秘(FC)是指由非器質性原因引起的便秘，主要表現為排便困難、排便次數減少或有排便不盡感[1-2]。隨著生活方式和飲食習慣的改變、社會老齡化以及過度使用瀉藥等情況發生，FC的發病率越來越高[3-4]。當代醫學對FC發病機制的研究較多，可能與腸道菌群失調[5]、腸道水液代謝[6-7]、腸神經系統相關神經遞質表達[8]等多種因素有關。

小承氣湯(Xiaochengqi Decoction)出自《傷寒論》，由大黃、厚樸、枳實3味藥組成，具有輕下熱結的功效。從方劑組成和用量來說，小承氣湯較大承氣湯少芒硝之品，厚樸、枳實量亦減，其治痞滿燥實堅未全者，除芒硝，欲其無傷下焦真陰也。適用于腑實已成而未甚之小熱小實證[9-10]。方中大黃所含的蒽醌類衍生物可通過增加腸黏膜蠕動，抑制腸內水分吸收，從而促進排便[11]。厚樸所含的厚樸酚可改善胃腸運動障礙[12]。枳實主要含有黃酮類、生物堿類、揮發油類等成分，對胃腸道平滑肌具有興奮作用[13]，其中所含的揮發油類可提高結腸的推進率，可起到破氣除脹、消積導滯的作用[14-15]。上述諸藥配合成方，具有較好的瀉下作用[16]。胡時友[17]研究發現，卒中后便秘患者運用小承氣湯配合中藥穴位貼敷治療后，可有效地改善患者的FC癥狀。李娜等[18]通過臨床試驗觀察到，糖尿病合并實熱便秘的患者在使用加味小承氣湯治療后取得了較好的療效。

中藥成分具有多樣性、復雜性的特點，其作用機制仍待探索，因而以系統生物學為基礎的網絡藥理學方法在中藥研究中得到了廣泛的應用[19-20]，在闡釋中藥及中藥復方多成分、多靶點的協同作用方面提供了系統性支持[21-22]。本研究采用網絡藥理學方法從分子網絡水平系統探索小承氣湯治療FC的作用機制，為后續實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 小承氣湯關鍵化學成分篩選

通過借助中藥系統藥理學數據庫分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php)檢索小承氣湯的所有有效成分，藥物篩選標準為口服生物利用度(oral bioavail-ability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[23]。最后得到的成分作為小承氣湯的活性成分。

1.2 小承氣湯-FC共同作用靶點篩選

利用TCMSP數據庫搜索小承氣湯關鍵化學成分的靶點信息，并通過UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)查詢與靶點相對應的人類基因名稱，再與通過GeneCards數據庫(https：//www. genecards.org/)、OMIM數據庫(https：//www.omim. org/)篩選出的FC的蛋白靶點基因進行映射，利用基迪奧生物平臺(https：//www.omicshare.com/)對小承氣湯化學成分靶標與FC相關靶標進行分析，得到99個共同作用靶點，并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-關鍵化學成分-疾病靶點網絡的可視化

將1.1項下得到的小承氣湯活性成分及1.2項下得到的小承氣湯-FC共同靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，得到藥物-關鍵化學成分-疾病靶點網絡，以節點表示關鍵化合物和靶點，以邊來表示節點之間相互作用的關系。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

將小承氣湯與FC的共同靶點基因導入STRING數據庫(https：//string-db.org/version 11.0)，使用“Multiple proteins”功能，物種設為“Homo sapiens(人類)”，設置最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)0.4，并隱藏出現的游離蛋白，其余參數保持默認設置，得到PPI網絡，分別以Png、TSV格式保存。紅色連線代表基因融合證據，藍色連線代表基因共進化證據，黃色連線代表文本挖掘證據等。再利用Cytoscape里的Centiscape 2.2插件計算度(degree)值，根據度值≥39作為篩選節點條件，并繪制柱狀圖。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

通過Bioconductor數據庫(http：//bioconductor.org/bioc Lite.R)查詢藥物-疾病共同靶點基因的ID。利用R語言安裝Bioconductor平臺相關安裝包[24]，進行GO富集分析和KEGG富集分析(P≤0.05)，輸出結果并繪制相關柱狀圖。

2 結果

2.1 小承氣湯有效成分篩選

共檢索到小承氣湯中269個化合物，其中大黃92個、厚樸139個、枳實65個。根據OB≥30%和DL≥0.18篩選后得到的40個化合物，其中大黃16個、厚樸2個、枳實22個。根據OB值排序，前30個化合物來源及其OB和DL值見表1。

表1 小承氣湯化學成分(根據OB排序前30位)

2.2 藥物-疾病靶點

通過TCMSP數據庫檢索40個關鍵化合物的靶點信息(共158個)，再通過UniProt進行基因ID的注釋(有的關鍵化合物的靶點信息在UniProt數據庫找不到對應的symbol則剔除)。通過GeneCards和OMIM數據庫搜索與FC相關的靶點基因，去重后共4556個。進一步得到小承氣湯化學成分靶標與FC相關靶標的交集，共99個靶點基因，得到相應的韋恩圖，見圖1。

注：橙色為FC靶點；綠色為小承氣湯靶點；黃色為共有靶點。圖1 小承氣湯與FC作用靶點韋恩圖

2.3 藥物-疾病-靶點網絡的構建

小承氣湯與FC作用靶點相關的關鍵化學成分有26種，見表2。再將疾病-有效成分-靶點網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，見圖2。

注：紫色圓形代表藥物；黃色圓形代表26個關鍵化學成分；紅色圓形代表疾病；綠色圓形代表99個靶點。圖2 小承氣湯藥物、活性成分與FC關鍵作用靶點網絡

表2 小承氣湯“成分-靶點”

續表2

2.4 關鍵靶點PPI網絡分析

將小承氣湯-FC共有的99個靶點導入STRING數據庫平臺，得到PPI網絡圖(見圖3)。圖中節點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關聯，共涉及98個節點、1421個邊，平均節點度為28.7。運用Centiscape 2.2軟件計算該網絡節點的度值，利用R語言軟件，選取度值前30位的節點繪制柱狀圖(見圖4)。這30個核心蛋白是整個網絡的靶心，是小承氣湯治療FC的潛在靶點。

注：節點表示蛋白；邊表示蛋白之間的關聯。圖3 小承氣湯治療FC相關靶點的PPI網絡

圖4 小承氣湯治療FC相關靶點PPI網絡的核心靶點

2.5 GO富集分析

GO富集分析結果顯示，共獲得108條GO生物過程，排名前20的生物學功能主要為核受體活性(8個靶點：AR、ESR2、ESR1、PGR、PPARG、RXRA、PPARA、SREBF1)、轉錄因子活性，直接的配體調節序列特異性DNA結合(8個靶點：AR、ESR2、ESR1、PGR、PPARG、RXRA、PPARA、SREBF1)、磷酸酶結合(12個靶點：BCL2、PPARG、AKT1、MAPK3、MAPK1、SOD1、HMGCR、PPARA、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14)、類固醇激素受體活性(7個靶點：AR、ESR2、ESR1、PGR、PPARG、RXRA、PPARA)、細胞因子活性(11個靶點：TNFSF15、IL1B、ADIPOQ、TIMP1、VEGFA、IL10、IL6、IL2、IFNG、IL4、CD40LG)、蛋白磷酸酶結合(9個靶點：BCL2、PPARG、AKT1、SOD1、HMGCR、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14)；泛素樣蛋白連接酶結合(12個靶點：SCN5A、JUN、BCL2、CASP8、CDKN1A、CCNB1、RELA、GS3KB、EGFR、RB1、NFKBIA、MDM2)等，見圖5。結果表明，小承氣湯可以通過參與多種生物學調控過程而發揮治療FC的作用。

圖5 小承氣湯活性成分治療FC關鍵靶點的GO生物學過程富集分析

2.6 KEGG富集分析結果

KEGG通路富集分析結果顯示，小承氣湯治療FC的關鍵基因靶點共獲得158條富集結果，主要富集的通路共有35條，其中顯著性最大的前20條通路見圖6。主要涉及白細胞介素-17(IL-17)信號通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路(PI3K/Akt signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等，表明小承氣湯的有效成分可以通過不同的靶點作用于不同的通路治療FC。而乙型肝炎(hepatitis B)、前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、大腸癌(colorectal cancer)等通路提示小承氣湯不僅可以治療FC，也還可以拓展治療其他疾病，體現了異病同治的原則。

圖6 小承氣湯對FC作用靶點的KEGG分析

3 討論

FC在中醫學當中屬于“便秘”“秘結”等范疇，早在西漢末年，《黃帝內經》就有關于便秘的記載，其描述為“大便難”“后不利”。此病與大腸傳導失常及肺、肝、腎、脾、胃等臟腑的功能失調有關[25]。臨床上FC常與其他疾病并見，如焦慮、抑郁[26]、心絞痛、心律失常、肝性腦病、腦卒中等[27-30]。

《傷寒論》第213條記載：“陽明病，其人多汗，以津液外出，胃中燥，大便必硬，硬則譫語，小承氣湯主之。若一服譫語止者，更莫復服。”小承氣湯是張仲景主治陽明腑實燥熱輕癥之經典方。方中大黃為君，味苦，性寒，長于瀉下攻積、瀉熱通便、蕩滌腸胃邪熱積滯；厚樸味苦，性溫，能除滿消脹；枳實味苦，性微寒，可行氣導滯除痞[31]。《本草衍義》指出：“枳實、枳殼，一物也。小則其性酷而速，大則其性詳而緩。故張仲景在承氣湯中用枳實，取其疏通決泄、破結實之義。”[32]。小承氣湯中三藥聯合加速積滯排泄，臨床應用小承氣湯加減治療FC效果頗佳，然而其作用機制仍需進一步探索。本研究通過對小承氣湯的有效成分、靶點、FC疾病靶點、GO及KEGG通路構建網絡進行綜合分析，發現不同成分之間存在多靶點協同作用。

從TCMSP數據庫得到的主要活性成分有大黃酸、蘆薈大黃素、異橙黃酮、柚皮苷、新橙皮苷等。蘆薈大黃素是存在于大黃等中藥植物中的主要生物活性蒽醌類化合物，已有證據表明，蘆薈大黃素具有多種藥理作用，包括抗癌、抗病毒、抗炎、抗菌、抗寄生蟲、保護神經和保護肝臟等作用。黃志芳等[33]經研究表明，P物質(SP)、血管活性腸肽(VIP)可作為胃腸運動調節中重要的興奮性和抑制性胃腸肽，廣泛分布在胃腸道中。王健等[34]通過實驗發現，蘆薈大黃素可能是通過增加FC模型小鼠肌間的神經叢SP、血管活性腸肽的含量，增強了FC小鼠的腸道動力，從而改善便秘的癥狀。然而亦有研究報道蘆薈大黃素有肝毒性和腎毒性等不良反應[35]。新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷具有促胃排空和提高小腸動力作用，其中橙皮苷發揮作用的機制可能與其增加胃動素的分泌有關[36]。研究表明，橙皮苷可通過5-羥色胺4受體/環磷酸腺苷信號通路(5-hydroxytryptamine 4R/cAMP signaling pathway)改善FC模型大鼠的結腸運動[37]。大黃酸、大黃素不僅具有均有較好的緩解便秘的作用[38-39]，其還能夠清除氧自由基，通過抑制光誘導單核細胞的轉移而發揮抗動脈粥樣硬化作用，表明大黃素和大黃酸有作為抗動脈粥樣硬化劑的潛力。因此可推測大黃在發揮通便作用的同時，亦可能起到了預防心血管事件發生的作用[40]。

通過PPI分析，找到30個關系密切的核心基因，說明這些靶點基因密切參與了小承氣湯對FC的治療。其中PTGS2和各活性成分關系較為密切，PTGS又叫環氧合酶(cyclooxygenase，COX)，是生物體內前列腺素合成起始步驟的關鍵酶，是生物活性脂類調節物包括前列環素、前列腺素和血栓烷素等各家族的前體。PTGS2即為誘導型COX-2，其是PTGS的同工酶之一，與腸道運動功能存在密切聯系。研究表明，在結腸不完全機械性腸梗阻大鼠模型中發現，當梗阻近端擴張的腸環行平滑肌收縮活性明顯下降時，COX-2 mRNA和蛋白的表達水平顯著上調；免疫組化研究顯示，COX-2在結腸平滑肌細胞中被選擇性誘導，體外拉伸結腸肌條或培養平滑肌能顯著誘導COX-2表達，而在COX-2基因缺陷型小鼠中，結腸梗阻中肌肉收縮力的損害減弱[41-42]。然而，小承氣湯是否通過調節COX從而發揮治療FC的作用還需要進一步實驗驗證。絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase，MAPK1)、MAPK3、MAPK8、MAPK14是MAPK信號轉導途經中重要的信號分子。當細胞表面受到各種不同的刺激后，MAPK信號通路被激活，將信號從細胞表面傳到細胞核內部，調節轉錄因子的活性，調控相應基因的表達，引起細胞反應。p38 MAPK是MAPKs家族成員之一[43-44]，p38 MAPK信號通路可能與水通道蛋白3(AQP3)、水通道蛋白9(AQP9)的表達有關聯，而AQP可影響結腸對水分的吸收和腸液分泌，從而導致便秘的發生[45-46]。

KEGG通路富集結果表明，小承氣湯治療FC主要與乙型肝炎信號通路、前列腺癌信號通路、PI3K-Akt信號通路、內分泌抵抗信號通路、IL-17信號通路、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路等有關。研究表明當PI3K/Akt信號通路被抑制時，Cajal細胞凋亡減少，可起到治療慢傳輸型便秘的作用[47]。孫宇等[48]研究發現，化瘀通便湯對慢傳輸型便秘大鼠PI3K-Akt信號通路具有一定的調控作用，說明PI3K-Akt信號通路在治療慢傳輸型便秘的過程中扮演了重要的角色。AGEs是由蛋白質、脂質和核酸的非酶促糖基化和氧化產生的一組復雜的化合物，這主要是由于衰老和某些病理狀況(如高血糖癥)引起。具有最佳化學特征的AGEs包括N-ε-羧基-甲基-賴氨酸(CML)、N-ε-羧基-乙基-賴氨酸(CEL)和咪唑酮等。AGEs的主要受體稱為RAGE或AGER，屬于免疫球蛋白超家族，已被描述為模式識別受體。AGE-RAGE信號傳導引起涉及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs的多個細胞內信號途徑的激活，然后引發核轉錄因子-κB(NF-κB)的活化。NF-κB促進促炎性細胞因子(如IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α)以及多種與動脈粥樣硬化相關的基因(包括血管細胞黏附分子-1、組織因子、血管內皮生長因子和晚期糖基化終產物受體)的表達。據報道，這些信號通路與糖尿病并發癥相關[49]。已有研究表明，糖尿病患者因體內長期高血糖，可導致胃腸神經功能紊亂，從而引發FC[50-51]。藥理研究表明，小承氣湯具有保肝的作用[52]，而本研究KEGG富集的主要通路之一是乙肝信號通路，推測小承氣湯可能通過乙肝信號通路發揮乙肝和FC的作用，表明了小承氣湯療效的多樣性。通過網絡藥理學驗證了小承氣湯多成分、多靶點、整體調節的作用特點，不僅預測了小承氣湯治療FC的主要作用機制，還拓寬了其臨床的用藥思路，為后續研究提供參考。