基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的百合抗抑郁作用機(jī)制研究△

何丹，黃建華，曾宏亮，黃小龍，舒駿，鄒篤準(zhǔn)，趙河，張水寒

湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410013

百合為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThumb.、百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker或細(xì)葉百合L.pumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉。其味甘、苦，性微溫，歸肺經(jīng)；兼有養(yǎng)陰潤肺、清心安神之效；用于肺熱咳嗽、干咳久咳、熱病后虛熱、煩躁不安。化學(xué)成分分析表明，百合的可食用鱗莖中含淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、多糖、皂苷和生物堿等成分，其中皂苷、類黃酮和多糖是百合的主要活性成分。

抑郁是因郁怒、思慮、悲哀、憂愁等情志不遂所致的心神失常[1]。《金匱要略》認(rèn)為，百合可滋養(yǎng)心肺之陰、補(bǔ)益心肺之氣，因而在古代神志病治療中應(yīng)用歷史悠久[2]。故百合清心安神可能是其抗抑郁功效的依據(jù)。現(xiàn)代研究證實(shí)，百合可提高抑郁癥大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)水平，同時降低血清皮質(zhì)醇(COR)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平及下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)mRNA水平，改善大鼠抑郁樣癥狀[3-5]。百合還可與地黃、知母、紫石等聯(lián)合用于糖尿病、腦卒中、慢性心力衰竭等并發(fā)抑郁的治療[6-7]。然而，由于中藥復(fù)雜的成分體系，百合抗抑郁涉及的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制尚不清晰。因此，解析百合治療抑郁的潛在作用機(jī)制可為百合及其復(fù)方解郁研究提供參考。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從網(wǎng)絡(luò)角度描述生物系統(tǒng)，通過整合大量實(shí)驗(yàn)及虛擬模型將傳統(tǒng)的“一靶，一藥”模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬W(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)，多組分治療”的模式，與中醫(yī)整體性原則一致，為闡明中藥和疾病之間的復(fù)雜性提供了可能[8-10]。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析及虛擬對接技術(shù)，從生物信息學(xué)的角度揭示百合多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的科學(xué)內(nèi)涵，揭示百合“清心安神”的抗抑郁潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為百合研究及相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建

以“百合”為關(guān)鍵詞檢索中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(TCMIP，http：//www.tcmip.cn/TCMIP/，ver.20)[11]、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[12]中相關(guān)成分，去除重復(fù)成分，經(jīng)文獻(xiàn)檢索驗(yàn)證后通過ChemBioDraw 14.0軟件繪制各化合物的分子結(jié)構(gòu)，并保存其Mol或SDF格式文件。

1.2 成分靶標(biāo)預(yù)測

采用SwissTargetPrediction(http：//www.swissta-rgetprediction.ch/)在線分析工具對百合活性成分的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測[13-14]。將上述百合活性成分文件上傳至Swiss Target Prediction網(wǎng)站，以“Homo sapiens”為背景預(yù)測靶點(diǎn)；以每個成分預(yù)測概率值>0.5的前15個靶點(diǎn)作為潛在有效靶標(biāo)建立成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫[15]。

1.3 抑郁靶點(diǎn)收集

以“depression”為關(guān)鍵詞、“Homo sapiens”為限定條件從GeneCards(https：//www.genecards.org/，ver.4.9.0)、OMIM(http：//www.omim.org/)、DrugBank (https：//www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫中初步篩選疾病相關(guān)靶蛋白，去除冗余靶點(diǎn)后，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，建立抑郁靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析

通過STRING(https：//string-db.org/，ver.11.0)數(shù)據(jù)庫將檢索到的百合活性成分靶點(diǎn)與抑郁相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行在線關(guān)聯(lián)，靶點(diǎn)基原選擇“Homo sapiens”；選擇相關(guān)性得分(interaction score)≥0.70的高置信度靶標(biāo)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用可視化軟件Cytoscape(ver.3.7.0)構(gòu)建百合成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)及百合成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。計算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)(node)及邊(edge)的拓?fù)鋵傩裕瑢⒍?degree)值≥10，且degree≥中介中心度(betweenness centrality，BC)值中位數(shù)2倍的靶點(diǎn)視為網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，作進(jìn)一步分析。

1.6 富集分析

進(jìn)行基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG，http：//www.genome.ad.jp/kegg/)通路的富集分析，選擇P≤0.05的條目進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2 結(jié)果

2.1 百合成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

從TCMIP及BATMAN數(shù)據(jù)庫中共檢索獲得11種百合化學(xué)成分。此外王百合苷類(regaloside B、C、E、F、I)雖未被數(shù)據(jù)庫收錄，但本課題組前期研究和文獻(xiàn)調(diào)研表明，其可能是百合質(zhì)量評價的潛在成分，且有研究表明，百合皂苷類成分是其抗抑郁的有效部位之一[16-18]，故將這5個化合物也納入網(wǎng)絡(luò)分析。百合成分信息見表1。對百合的16個活性化合物進(jìn)行Swiss Target Prediction在線預(yù)測，刪除冗余成分后共獲得110個潛在靶點(diǎn)(見表2)。應(yīng)用Cytoscape建立百合成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(126個節(jié)點(diǎn)，300條邊)，見圖1。

表1 百合潛在活性成分

表2 百合潛在作用靶點(diǎn)

續(xù)表2

注：粉色六邊形代表靶點(diǎn)；綠色倒三角表示成分。圖1 百合成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)分析

2.2.1百合抗抑郁潛在靶點(diǎn) 以“depression”為關(guān)鍵詞從GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫中共獲得9719個與抑郁發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。將預(yù)測的百合潛在靶點(diǎn)與抑郁靶點(diǎn)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)95個百合-抑郁的共有靶點(diǎn)(見圖2)。

圖2 百合-抑郁共有靶點(diǎn)

2.2.2百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò) 將上述95個共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行在線靶點(diǎn)互作分析；選取交互作用得分≥0.7的高可信度靶點(diǎn)，構(gòu)建百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。該網(wǎng)絡(luò)包括88個節(jié)點(diǎn)、274條邊。其中節(jié)點(diǎn)度值排名前10的靶點(diǎn)為百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

注：粉色代表靶點(diǎn)；紅色代表排名前10位的靶點(diǎn)。圖3 百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的常駐巨噬細(xì)胞，其異常激活或衰減將誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]或抗炎細(xì)胞因子的釋放，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致抑郁的發(fā)生，因此，小膠質(zhì)細(xì)胞可能是減輕各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理變化的潛在靶標(biāo)[19-22]。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)可在慢性應(yīng)激條件下通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞來減少抑郁樣行為[23]。Kwon等[23]研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)的缺失可促進(jìn)M-CSF在神經(jīng)元細(xì)胞中的合成，激活蛋白激酶B(Akt)/糖原合成激酶3β(GSK3β)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)等抗抑郁類信號通路的磷酸化。Kang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Akt1可通過維持線粒體膜電位的不對稱性及調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶活性來防止炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞活化，預(yù)防神經(jīng)退行性損傷。有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過直接影響許旺細(xì)胞(Schwann cells)、神經(jīng)元祖細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，抗抑郁類藥可誘導(dǎo)海馬VEGF的表達(dá)；這可能與其調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元發(fā)育以及大腦血管的分化和形成有關(guān)[25]。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)，慢性不可預(yù)性的壓力(CUS)將加速認(rèn)知障礙的發(fā)生，并導(dǎo)致海馬淀粉樣β(APP)片段顯著增加。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測百合可能通過直接或間接的方式參與上述靶點(diǎn)的調(diào)控，通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞激活或衰減，參與E2水平的調(diào)節(jié)等發(fā)揮其多靶點(diǎn)抗抑郁的作用(見圖4)[31]。

圖4 百合潛在抗抑郁靶點(diǎn)

2.3 百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)群(Cluster)分析

使用MCODE工具對PPI靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)群分析，共獲得8個中心靶標(biāo)簇(見表3和圖5)。選擇得分大于4的前3個模塊(群集1～3)分析百合-安神PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要網(wǎng)絡(luò)群。

表3 百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)分類信息

丁騰等[32]構(gòu)建百合地黃湯抗抑郁網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)該方可通過抑制腦內(nèi)腎上腺素β受體(ADRB)功能亢進(jìn)，促進(jìn)凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2的表達(dá)，抑制大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗抑郁作用。本研究中也發(fā)現(xiàn)百合可作用于ADRA與ADRB 2種腎上腺素受體基因的多個亞型，這些受體功能缺失被認(rèn)為與情緒記憶和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙有關(guān)[33]。王博龍等[34]構(gòu)建百合知母湯抗抑郁網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)該方可通過調(diào)節(jié)ERK1/2、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、Akt、MAPK等靶點(diǎn)，增加海馬神經(jīng)突觸的可塑性來緩解抑郁癥狀，這與本研究預(yù)測結(jié)果一致。此外這2個網(wǎng)絡(luò)均發(fā)現(xiàn)百合可協(xié)同地黃或知母作用于5-羥色胺受體(HTR)，修復(fù)受損的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能而發(fā)揮抗抑郁作用。本研究在百合潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測中發(fā)現(xiàn)其另一亞型HTR2B，但在網(wǎng)絡(luò)分析中該靶點(diǎn)未列于關(guān)鍵靶點(diǎn)中，造成這一差異的原因可能是數(shù)據(jù)庫的選擇差異及多藥材共作的結(jié)果。

注：Cluster 1～8表示8個中心靶標(biāo)簇。圖5 百合-抑郁PPI網(wǎng)絡(luò)群分類

2.4 百合抗抑郁潛在靶點(diǎn)的KEGG分析

為了闡明百合治療抑郁的潛在機(jī)制，在PPI網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上對88個高置信度靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集，共富集到20條生物通路；進(jìn)一步構(gòu)建了百合抗抑郁的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)(見圖6～7和表4)。該網(wǎng)絡(luò)由88個節(jié)點(diǎn)(包括16個成分節(jié)點(diǎn)、52個抑郁相關(guān)節(jié)點(diǎn)和20條通路節(jié)點(diǎn))和472條邊組成。通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果展示了百合成分與靶點(diǎn)、蛋白與蛋白、蛋白與通路間的串?dāng)_和傳遞關(guān)系，從現(xiàn)代藥理角度解釋了百合多成分、多靶點(diǎn)、多途徑參與抗抑郁的潛在分子機(jī)制。

表4 基于PPI網(wǎng)絡(luò)的KEGG分析

圖6 百合抗抑郁成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的KEGG富集分析

注：粉色六邊形代表靶點(diǎn)；綠色倒三角表示成分；藍(lán)色三角形代表通路。圖7 百合抗抑郁成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

越來越多的證據(jù)支持抗炎在抗抑郁中的積極作用。研究表明，高糖可促進(jìn)晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)和其受體RAGE間的相互作用，進(jìn)而上調(diào)致炎基因和氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與糖尿病神經(jīng)病變。研究證實(shí)，抑制海馬和前額葉皮層中的AGE-RAGE信號傳導(dǎo)可改善糖尿病并發(fā)抑郁和焦慮等癥狀[35-36]。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)激活直接受小膠質(zhì)細(xì)胞中PI3K/Akt磷酸化的調(diào)節(jié)，這暗示抑制PI3K/Akt可能有助于預(yù)防神經(jīng)炎癥[37-38]。此外，PI3K-Akt通路還可與ERα相互調(diào)節(jié)，改善雌激素水平，從而在圍絕經(jīng)期抑郁癥大鼠模型中發(fā)揮抗抑郁樣作用[39-40]。大腦是脂質(zhì)含量最豐富的器官之一，鞘脂及其代謝酶在大腦神經(jīng)元信息流和傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可通過自分泌/旁分泌信號傳導(dǎo)方式參與小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的活化，誘發(fā)抑郁[41-44]。Dectin-1是第一個被發(fā)現(xiàn)的非Toll樣受體，其可誘導(dǎo)抗炎因子的表達(dá)，并通過不依賴Syk的途徑終止炎癥過程，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)重塑，發(fā)揮抗抑郁和免疫調(diào)節(jié)作用[45-46]。

綜上分析，百合可能通過糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、鞘脂信號通路、松弛素信號通路、C型凝集素受體信號通路、雌激素信號通路等參與免疫調(diào)節(jié)、抗炎；通過星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)元和突觸重塑等相關(guān)途徑發(fā)揮抗抑郁作用。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示百合治療抑郁的分子機(jī)制，分別構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”“蛋白-蛋白”和“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)百合抗抑郁的16個潛在活性成分、88個潛在靶點(diǎn)和10條生物通路。百合可通過多靶點(diǎn)(STAT3、Akt1、JUN、VEGFA、TNF、APP、MAPK14、ESR1、AR和HSP90AA1等)參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活或衰減及雌激素水平的調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮抗抑郁作用，其中AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、鞘脂信號通路、C型凝集素受體信號通路、雌激素信號通路可能是其抗抑郁關(guān)鍵途徑。百合類皂苷(王百合苷A～F、I)可作用多個靶點(diǎn)，可能是百合及百合類復(fù)方抗抑郁成分群。本研究為百合及其復(fù)方抗抑郁的臨床應(yīng)用提供了參考。