鉤吻屬植物及其易混品五指毛桃的DNA條形碼比較分析△

王虹，蘇暢，張文嫻，劉雪婷，呂浩鋒，王鐵杰，魏鋒，馬雙成，王淑紅*

1.深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 518057；2.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族檢定所，北京 100050

鉤吻是兩廣地區的地方習用藥材[1-2]，為馬錢科植物鉤吻Gelsemiumelegans(Gardn.et Champ.) Benth.的干燥根和莖，具有消腫拔毒、祛風止痛的功效。因其為毒性藥材，故又名斷腸草，在民間多以外敷，用于消腫止痛[3]。北美鉤吻G.sempervirens(L.) J.St.-Hil.原產于北美，通過園藝引入中國，同為毒性植物[4]。由于北美鉤吻與鉤吻為馬錢科鉤吻屬僅有的2個近緣物種，且兩者為戶外常見的品種，容易被采挖帶來誤食風險。五指毛桃為桑科植物粗葉榕FicushirtaVahl.的干燥根，味甜，性平，具有益氣健脾、祛痰化濕，是華南地區習用藥食同源的中藥材[5]。近年來，將鉤吻的根誤認為是五指毛桃而導致的中毒案件時有發生[6-7]，但目前尚無用于區分五指毛桃與鉤吻屬植物的分子鑒別方法。本研究采用DNA條形碼鑒定技術，選取內轉錄間隔區2(ITS2)與psbA-trnH 2種序列對鉤吻、北美鉤吻及易混品種五指毛桃進行測序和分子鑒定，為鉤吻屬植物的鑒別及確保五指毛桃的藥食兩用安全性提供參考。

1 材料

1.1 藥材

本研究收集的鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃藥材樣本均經中國食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定，樣品信息見表1。另從GenBank數據庫下載鉤吻ITS2序列3條、psbA-trnH序列4條，北美鉤吻ITS2序列1條、psbA-trnH序列1條，五指毛桃ITS2序列3條、psbA-trnH序列1條，序列信息見表2。

表1 鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃樣品信息

表2 鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃GenBank來源序列信息

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；2×TaqPCR Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司)；引物合成與測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司負責。

1.3 儀器

VERITI聚合酶鏈式反應(PCR)儀(ABI公司)；Nanodrop 2000型核酸蛋白分析儀(Thermo公司)；PowerPac Basic型電泳系統(Bio-Rad公司)；GBOX F3型凝膠成像系統(Syngene公司)。

2 方法

2.1 總DNA提取

將植物葉片或藥材用無水乙醇擦拭表面消毒，室溫放置直至乙醇充分散盡后，用液氮研磨至細粉。稱取細粉100 mg，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，于-20℃保存備用。

2.2 PCR擴增與測序

采用ITS2和psbA-trnH條形碼通用引物[8]進行模板DNA質量的考察和DNA條形碼鑒別，引物序列見表3。PCR反應體積25 μL，包含2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，總DNA 2.0 μL，用滅菌超純水補足反應體積。ITS2擴增程序為94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，45 s(循環40次)；72 ℃延伸10 min。psbA-trnH條形碼的擴增程序為94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，55 ℃，1 min，72 ℃，1.5 min(循環30次)；72 ℃延伸7 min。PCR產物經上海美吉醫藥科技有限公司測序。

表3 引物序列

2.3 分子生物學數據分析

采用Codon Code Aligner軟件對測序峰圖和序列進行校對、拼接并去除正反向引物序列。ITS2序列需登陸ITS2 Database網站(http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)去除各樣品序列兩端5.8 S和28 S區。采用BankIt工具在GenBank數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/submit/)中提交ITS2與psbA-trnH序列。采用BioEdit軟件進行ITS2和psbA-trnH基因的多序列比對，查看并分析堿基變異位點。采用MEGA 5.1軟件的Kimura 2-parameter(K2P)雙參數模型計算進行種間、種內遺傳距離分析，并基于鄰接(neighbor-joining，NJ)法構建系統進化樹。

3 結果

3.1 psbA-trnH序列特征

堿基序列分析結果表明，鉤吻的psbA-trnH序列長度為540～546 bp，GC占比為26%～27%，具有4種單倍型；北美鉤吻的psbA-trnH序列與鉤吻存在明顯差異，長度僅為286 bp，GC占比為32%～33%，具有2種單倍型；五指毛桃基原植物粗葉榕樣本得到的psbA-trnH序列長度為440 bp，GC占比為24%，只有1種單倍型(見表4)。K2P參考模型計算的種內和種間的遺傳距離結果表明，鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃的psbA-trnH序列平均遺傳距離分別為0.005 606、0.003 506和0，種內變異較小；但五指毛桃的psbA-trnH序列堿基序列與鉤吻和北美鉤吻具顯著差異，同時鉤吻和北美鉤吻的最大種內遺傳距離小于最小種間遺傳距離(見表4)。但五指毛桃根類藥材樣本(Fh01、Fh02)未成功擴增出psbA-trnH序列，這可能是因為該物種的根部不含有葉綠體，因此無法得到葉綠體psbA-trnH基因序列。因此psbA-trnH序列可作為鉤吻和北美鉤吻鑒定首選DNA條形碼。

3.2 ITS2序列特征

堿基序列分析結果表明，鉤吻的ITS2序列長度為228～230 bp，GC占比為72%～73%，具有3種單倍型，種內變異位點較少；北美鉤吻ITS2序列長度為228～229 bp，GC占比為69%～70%，具有2種單倍型；K2P參考模型計算的種內和種間遺傳距離結果表明，鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃的ITS2序列的種內的平均遺傳距離分別為0.002 937、0.018 200和0.008 016，種內變異較小；但五指毛桃的ITS2堿基序列與鉤吻和北美鉤吻具有顯著差異，同時鉤吻和北美鉤吻的最大種內遺傳距離小于最小種間遺傳距離(見表4)，表明ITS2序列既可作為鉤吻與北美鉤吻的DNA鑒別條形碼，也可以作為區分五指毛桃與鉤吻屬植物的DNA鑒定條形碼。

表4 鉤吻、北美鉤吻ITS2和psbA-trnH序列分析

3.3 系統進化樹的構建與聚類分析

基于ITS2序列和psbA-trnH序列采用鄰接法分別建立系統進化樹，并以此進行鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃的聚類分析。結果顯示，鉤吻和北美鉤吻在2個系統進化樹中均聚集成為第一分支，五指毛桃聚為另一分支，此外鉤吻和北美鉤吻又分別聚為兩級分支，這說明采用2種DNA條形碼序列建立的進化樹均能將鉤吻屬植物與五指毛桃進行有效區分(見圖1～2)。

圖1 基于ITS2序列構建鉤吻、北美鉤吻與五指毛桃NJ樹

圖2 基于psbA-trnH序列構建鉤吻、北美鉤吻與五指毛桃NJ樹

但在ITS2系統進化樹中，鉤吻存在不明顯的分支亞群，且支持率較低(支持率為60%、93%)；而鉤吻在psbA-trnH系統進化樹中無分支亞群，且支持率為100%。這可能是在不同DNA條形碼序列中，鉤吻屬植物的種內變異和種間差異的結果不同導致。從聚類分析結果的穩定性方面分析，psbA-trnH序列更優于ITS2序列。

4 討論

DNA條形碼技術具有快速、準確等特點，在物種鑒定領域迅猛發展。對于樣本量少、性狀相近的中藥品種，DNA條形碼技術具有極大優勢，目前已成為中藥傳統鑒定方法的重要補充[9-10]。陳士林課題組以大量的藥用植物及其相關物種作為研究對象，對7個候選DNA條形碼進行篩選和深入分析，最終確定以ITS2為主的藥用植物鑒定的條形碼原則[11]，目前已收載于《中華人民共和國藥典》2015年版四部“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則”及一些著作中[8，12]，對中藥DNA條形碼的標準化做出了卓越的貢獻。ITS2區在薔薇科、蕓香科、菊科等大部分藥材品種中具有較高的鑒定成功率，這是由于ITS2區在這些物種間具有較快的進化速率，因此產生較多的種間差異位點[13-16]。本研究結果表明，ITS2區和psbA-trnH區序列均可作為鉤吻屬植物鑒定的DNA條形碼，但psbA-trnH區在鉤吻屬植物中堿基序列長度、種間變異位點數量均具有顯著差異，同時系統進化樹聚類結果穩定性更強，因此psbA-trnH序列比ITS2序列更適合作為鉤吻屬植物鑒別的DNA條形碼。psbA-trnH基因是葉綠體psbA和trnH基因之間的一段非編碼區，進化速度較快，雖然目前作為中藥基原鑒定的備選DNA條形碼，但也有研究表明，其對于石斛屬植物也具有良好的鑒別能力[17]，同時對于忍冬屬植物和連翹屬植物的鑒別甚至優于ITS2條形碼，甚至還可對連翹藥材的產地進行鑒別，表明對于某些中藥品種可將psbA-trnH作為主要鑒別條形碼。

鉤吻和北美鉤吻是具有多個種內變異位點的近緣植物，若采用序列相似度或序列變異位點作為鑒別指標，若物種進化出新的變異位點，可能會造成檢驗人員的困擾。采用DNA條形碼系統進化樹進行評價，聚類結果更直觀，因此更適合質量標準的結果表述，可作為中藥DNA條形碼方法的另一種結果表述形式。本研究還發現，鉤吻與北美鉤吻的psbA-trnH序列長度存在顯著差異，因此無需進行PCR產物的測序，可直接采用瓊脂糖凝膠電泳的方法根據DNA條帶分子量進行快速鑒定。

鉤吻屬植物因其花朵繁盛、花香清幽，是戶外常見的花卉園藝植物[18-21]。但鉤吻屬植物含有吲哚類生物堿，也是毒性植物。其中鉤吻在我國屬于區域性使用的藥材，但因其應用范圍較小，且多以外用，因此尚未在藥用領域發現質量安全問題。但鉤吻作為劇毒的中藥材，因其花與金銀花相似、根與五指毛桃相似，故常因誤認采挖食用而導致中毒事件，造成了嚴重后果。鉤吻屬另一物種北美鉤吻也為劇毒植物，因此具有較高的安全風險[22]。本研究采用ITS2和psbA-trnH條形碼建立了鉤吻、北美鉤吻、五指毛桃的鑒別方法，為藥食同源的有毒易混品的鑒別提供了新思路，為保障食用和用藥安全提供了有效手段。