比較基因組雜交芯片在自然流產(chǎn)和胚胎停育病因診斷中的應(yīng)用價值分析

藺美娜 陳薪任 倪香 李歡 隋鈺 趙寧 姜淼 盧永平

作者單位：110031 沈陽，遼寧省計劃生育科學(xué)研究院 中國醫(yī)科大學(xué)附屬生殖醫(yī)院 優(yōu)生遺傳科

自然流產(chǎn)和胚胎停育是臨床上常見的異常妊娠結(jié)局，前者指妊娠不滿28周、胎兒體重不足1 000 g，妊娠自行終止，發(fā)生率約為15%～25%[1]；后者指孕早期的胚胎死亡，超聲檢查孕囊內(nèi)有形態(tài)不規(guī)則的胚芽或胎兒、無心管搏動，發(fā)生率約為20%[2]。自然流產(chǎn)和胚胎停育的產(chǎn)生原因十分復(fù)雜，包括遺傳、免疫、感染、理化、環(huán)境、內(nèi)分泌等，其中染色體異常是主要原因。核型分析技術(shù)是臨床上染色體診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，針對流產(chǎn)絨毛組織的核型分析，必須在無菌狀態(tài)下獲取絨毛組織，進(jìn)行2～3周的細(xì)胞培養(yǎng)，但不能分辨＜5 MB的染色體變異，容易導(dǎo)致檢測失敗或漏診[3]。比較基因組雜交芯片(Comparative Genomic Hybridization Array, aCGH)技術(shù)，可以在全基因組范圍內(nèi)同時檢測染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常(微缺失和微重復(fù))，并能較準(zhǔn)確地測定其大小，具有檢測周期短(3 d)、分辨率高(可檢測50 kb甚至更小的染色體變異)等優(yōu)點。本研究通過對58例流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行aCGH分析，探討aCGH技術(shù)在流產(chǎn)原因探查中的可行性，分析早期流產(chǎn)和胚胎停育與染色體異常的相關(guān)性?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年5月—2019年5月在我院就診的27例自然流產(chǎn)和31例胚胎停育患者，所有患者均行清宮術(shù)；年齡22～48歲，孕周7～16周；其中10例為輔助生殖技術(shù)治療后懷孕者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)陰道彩超檢查提示胚胎停止發(fā)育；②患者具有流產(chǎn)史或胚胎停育史；③此次孕期均已排除支原體、衣原體、TORCH感染病史及其他病毒接觸史；④無嚴(yán)重宮內(nèi)疾病，無子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等影響胚胎著床因素；⑤無自身免疫性疾??；⑥男方無精子發(fā)育不良史；⑦患者簽署知情同意書，同意采用aCGH技術(shù)對流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本處理及基因組D N A提取 清宮術(shù)獲取絨毛組織，用無菌生理鹽水沖洗2～3次，除去母血污染，取大約25 mg組織，用剪刀剪碎，通過QIAGEN Blood & Tissue試劑盒(德國QIAGEN公司)提取組織基因組DNA。使用NanoDrop 1 000紫外分光光度計和Qubit 3.0(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定DNA濃度。

1.2.2 aCGH芯片檢測 使用Agilent公司8×60 K芯片進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，步驟如下：基因組DNA定量、片段化、熒光染料標(biāo)記和純化，67 ℃雜交24 h、洗滌，用Surescan芯片掃描儀掃描，利用CytoGenomics 3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 aCGH芯片結(jié)果判讀 參考常用國際公共數(shù)據(jù)庫DGV、DECIPHER、ISCA、PubMed及相關(guān)文獻(xiàn)報道等進(jìn)行結(jié)果判讀。根據(jù)染色體變異的性質(zhì)，結(jié)果分為致病、可能致病、臨床意義不明、可能良性、良性五類。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究對收集到的數(shù)據(jù)采用描述性統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常類型分布 58例流產(chǎn)絨毛組織樣品通過aCGH芯片進(jìn)行檢測，成功率100%，共有42例(72.41%)檢出異常染色體，其中染色體數(shù)目異常26例、結(jié)構(gòu)異常16例，見表1，各種染色體變異的典型舉例見圖1。

2.2 非整倍體異常檢出情況 42例異常染色體中共檢出26例(61.90%)染色體非整倍體異常，其中常染色體三體20例，雙染色體三體、常染色體單體各3例。見表2。

2.3 染色體結(jié)構(gòu)異常分布 42例異常染色體患者中共檢出染色體結(jié)構(gòu)異常16例(38.10%)，其中微重復(fù)2例、微缺失10例、微缺失+微重復(fù)2例、等臂染色體1例、等臂染色體+染色體單體1例。見表3。

3 討論

染色體核型分析仍然是臨床上遺傳病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是對于流產(chǎn)絨毛組織的檢測，首先需要臨床醫(yī)師在行清宮術(shù)時無菌取得絨毛組織，然后進(jìn)行絨毛組織細(xì)胞培養(yǎng)。該法周期長，同時受細(xì)胞活力、細(xì)菌污染、培養(yǎng)條件、操作手法、母體細(xì)胞污染等因素的影響，絨毛細(xì)胞培養(yǎng)成功率不足80%[4]，而且核型分析通量低、耗時耗力、分辨率低，僅能發(fā)現(xiàn)＞5 MB的染色體異常，無法發(fā)現(xiàn)較小的致病性微缺失和微重復(fù)，導(dǎo)致很多病例無法得到準(zhǔn)確結(jié)果，限制了核型分析在流產(chǎn)組織遺傳學(xué)檢測中的應(yīng)用[5]。aCGH芯片是近年來興起的染色體檢測技術(shù)，可以在全基因組范圍內(nèi)檢測出染色體異常，包括染色體非整倍體、微缺失、微重復(fù)等。

表1 42例流產(chǎn)絨毛組織異常染色體分布

圖1 aCGH芯片檢出典型染色體異常結(jié)果

表2 流產(chǎn)絨毛組織染色體非整倍體檢出情況分布

本研究對58例流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行aCGH芯片檢測，實驗成功率100%，檢出染色體異常42例，其中染色體數(shù)目異常26例，是導(dǎo)致流產(chǎn)和胚胎停育的主要原因。本研究檢出16三體最多，與Qu等[6]用SNParray法和Jia[7]用FISH法檢測的早期流產(chǎn)染色體異常結(jié)果一致。研究顯示[8-9]，在流產(chǎn)原因中16、21、22三體比較集中，本研究檢出結(jié)果則集中在16、2、8三體，21、22三體檢出率較低，差異的原因可能與納入樣本量、患者年齡、地域等差異有關(guān)。

雙染色體三體指同一個核型中出現(xiàn)兩種三體，是較少見的染色體異常。本研究檢出3例雙染色體三體，檢出率為7.14%，高于Shearer等[10]的研究結(jié)果(采用核型分析雙染色體檢出率為3%，F(xiàn)ISH雙染色體檢出率為0.5%)。FISH對雙染色體三體檢出率低，與探針的種類和對染色體非整倍的覆蓋范圍有關(guān)，該法不適用于染色體異常的篩查，更適合對已知結(jié)果的驗證。

本研究共檢出染色體結(jié)構(gòu)異常1 6 例(38.10%)，高于以往的報道[11]，這可能與本研究樣本量少、受檢對象的選擇及aCGH芯片靈敏度和分辨率高有關(guān)。本研究檢出染色體微重復(fù)2例，分別出現(xiàn)在11號和18號染色體；檢出微缺失10例，主要集中在2、7、12、19、22號染色體，這些染色體微缺失區(qū)域都含有與發(fā)育相關(guān)的重要基因，缺失后導(dǎo)致胎兒整體發(fā)育遲緩、智力障礙、心臟異常、額面部異常、心血管異常等，具有胚胎致死性，可能是導(dǎo)致流產(chǎn)及死胎的主要原因。本研究檢出2例攜帶染色體微缺失+微重復(fù)，其中1例攜帶7q21.3～22.1微缺失合并11p13～15.1微重復(fù)，7q21.3～22.1微缺失區(qū)域含有AP1S1、SERPINE1、PLOD3等 72個OMIM基因，與身材矮小、全身發(fā)育遲緩等相關(guān)；11p13～15.1微重復(fù)區(qū)域包含ANO3、BDNF等43個OMIM基因，主要與腦病等有關(guān)。另1例為11p11.2微缺失合并11q24.3～25微重復(fù)，11p11.2微缺失區(qū)域包含ACP2、AGBL2、CKAP5等29個OMIM基因，與全身發(fā)育遲緩、肥厚性心臟病等有關(guān)；11q24.3～q25微重復(fù)區(qū)域包含IGSF9B、JAM3、VPS26B等10個OMIM基因，與全身發(fā)育遲緩、精神障礙、智力障礙、面部畸形、心臟畸形、中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成遲滯等有關(guān)。上述結(jié)果提示，與早期流產(chǎn)和胚胎停育相關(guān)的染色體結(jié)構(gòu)異常比較復(fù)雜，不僅涉及單一缺失或重復(fù)，還可以表現(xiàn)為多種異常結(jié)構(gòu)的復(fù)合。

表3 流產(chǎn)物絨毛組織染色體結(jié)構(gòu)異常分布

本研究不足之處：納入樣本量較少，統(tǒng)計結(jié)果與文獻(xiàn)報道可能存在較大偏差；沒有從流產(chǎn)/胚胎停育次數(shù)、孕婦年齡、是否為輔助生殖懷孕等方面進(jìn)行分類統(tǒng)計和相關(guān)性分析；對aCGH芯片檢出異常的絨毛組織，沒有對其父母進(jìn)行溯源驗證，因此不能進(jìn)行流產(chǎn)/死胎與父母的遺傳學(xué)關(guān)系分析；除了公用數(shù)據(jù)庫明確報道的致病性微重復(fù)和微缺失，其余不明確臨床意義、可能良性、良性、不致病等檢查結(jié)果均被納入陰性結(jié)果；比較基因組芯片不能檢測易位、倒位、突變的異常，可以通過與其他方法聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行彌補(bǔ)；另外，對于未檢出染色體異常的樣本未做其他方面的分析。

綜上所述，胚胎染色體異常是引起流產(chǎn)和胚胎停育的主要遺傳學(xué)因素，流產(chǎn)絨毛遺傳學(xué)檢查不僅能夠?qū)ε咛ネＳM(jìn)行病因?qū)W診斷，同時對患者的合理治療和再生育的優(yōu)生指導(dǎo)具有重要意義。aCGH芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的核型分析相比較，具有周期短、分辨率高、無需細(xì)胞培養(yǎng)，以及可以直接快速在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常等優(yōu)勢，提高了染色體異常檢出率，是進(jìn)行流產(chǎn)物及死胎組織遺傳學(xué)分析的有效手段，具有很高的臨床應(yīng)用價值。