對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌生物學特性及侵染毒力的影響

趙靜 常繼東 鄭麗君 王志遠

摘要：明確對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌侵染毒力的影響，可為克服三七連作障礙提供有效的策略。結合熒光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）染色及馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板萌發法，分析不同濃度下對羥基苯甲酸與尖孢鐮刀菌孢子活性的相關性;采用酶學法分析不同濃度下對羥基苯甲酸對真菌纖維素酶分泌的影響。FDA-PI染色結果表明，當對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，尖孢鐮刀菌產孢數量最多，孢子活性最強。PDA平板萌發測定結果顯示，對羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時，尖孢鐮刀菌孢子的平均萌發率為58.05%，孢子萌發率最高。低濃度的對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加，而高濃度下降低;對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，纖維素酶活性最高，峰值出現在培養4d時，達到1.57U/mL，是相同時間下對照的5.6倍。研究表明，低濃度對羥基苯甲酸（1～5mmol/L）脅迫有利于尖孢鐮刀菌孢子生長，且提高其分泌的纖維素酶活性。

關鍵詞：對羥基苯甲酸;尖孢鐮刀菌;孢子活性;纖維素酶

中圖分類號：S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0291-04

作者簡介：趙靜（1983—），女，云南玉溪人，博士，副教授，主要從事作物病蟲害與防治研究。E-mail：hujun_maolv@163.com。

通信作者：王志遠，博士，副教授，主要從事作物病蟲害與防治研究。E-mail：yuan33441@sina.com。

三七根腐病是三七生產中的一類重要病害，不僅影響三七產量，更影響三七質量，其中以鐮刀菌型根腐病最為多見[1]。在三七栽培中，隨著連作年限的延長根腐病發病率明顯增加[2]。根腐病的發生與連作條件下植物根系分泌物對病原菌的化感作用有密切關系。研究三七根系分泌物對病菌的化感致病性是解析連作條件下根腐病形成機制的有效途徑。

在植物的生長發育過程中，根系作為植物與土壤的接觸部分，不僅從土壤中吸收水分和養分，還通過分泌的方式向周圍釋放一些無機離子和有機化合物，這些物質是一類復雜的混合物，是植物連作對根際土壤微生物產生影響的重要媒介之一，參與植物與周圍環境的物質交換與信號傳遞，是根際最為重要的營養和能量來源，也是構成植物不同根際微生態特征的關鍵因素[3-5]。對羥基苯甲酸為酚酸類化感物質，是自然界中常見的化合物，存在于高等植物、微生物、苔蘚和土壤中。酚酸類物質是導致作物產生連作障礙的主要因素，它可以直接或間接地促進或抑制微生物生長，進而影響作物生長。Ren等研究了叢枝菌根定殖是否能緩解西瓜枯萎病，改變植物對病原菌的反應，結果表明，叢枝菌根的侵染抑制了西瓜根和根際病原菌的生長，使病害指數降低了89.3%，這是因為叢枝菌根的侵染改變了根系分泌物，抑制了西瓜枯萎病菌孢子的萌發[6]。郝文雅等以不同抗性西瓜品種以及化感水稻品種為試驗對象，對其根系分泌物中可溶性糖和游離氨基酸的含量和組成進行分析，并研究了氨基酸對西瓜專化型尖孢鐮刀菌生長的影響，結果表明，西瓜的根系分泌物能夠促進鐮刀菌孢子萌發和產孢，而水稻根系分泌物卻具有反向作用[7]。

本研究擬探究對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌的生物學特性及致病毒力，以探明對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌的化感作用，以期為連作條件下根腐病的發生及病害防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗菌株及試驗時間

尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）由云南農業大學植物病理學重點實驗室惠贈。試驗于2019年在玉溪師范學院分子生物學實驗室進行。

1.2孢子活性的檢測

1.2.1孢子懸浮液的制備

將尖孢鐮刀菌菌株分別在含有1、5、10、50mmol/L對羥基苯甲酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中于26℃下振蕩培養7d，以不添加對羥基苯甲酸的PDA培養基為對照（CK）。將培養好的病原菌孢子混合液依次用200目（孔徑0.075mm）和300目（孔徑0.048mm）篩網過濾，去除菌絲和培養基雜質。然后取30mL濾液于50mL離心管中，在5000r/min下離心5min，去上清液后以無菌水進行重懸并離心，重復2～3次。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH值為7.4）將孢子重懸。

1.2.2FDA-PI熒光染液的配制、染色及孢子死亡率的計算

熒光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）熒光染液的配制及染色參照柴阿麗等的方法[8]，尖孢鐮刀菌孢子懸浮液染色后于熒光顯微鏡下觀察，采用血細胞計數器根據孢子著色情況計算孢子死亡率。

1.3孢子萌發率的計算

制備對羥基苯甲酸濃度分別為1、5、10、50mmol/L的PDA培養基，以不添加對羥基苯甲酸的PCA培養基為對照（CK）。把滅過菌的微孔濾膜平鋪在制備好的PDA平板上，使微孔濾膜平鋪于培養基表面，把制備的孢子懸浮液平鋪在濾膜上，用三角玻璃棒將菌懸液涂布均勻（每個平板涂布70μL菌懸液），用封口膜封口后置于28℃下培養，5～8h后制作玻片觀察并記錄孢子的萌發情況，每個處理重復3次，每個樣本檢查100個孢子，統計孢子萌發率。

1.4酶活性的測定

纖維素酶活性的測定采用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）法。

2結果與分析

2.1FDA-PI熒光染色效果觀察和孢子死亡率的計算

尖孢鐮刀菌新鮮孢子懸浮液利用FDA染液單染后，在熒光顯微鏡下，活孢子呈亮綠色熒光（圖1-a）;經加熱致死的孢子利用PI染液單染后，死孢子發出紅色熒光（圖1-b）。取1mL新鮮孢子懸浮液與1mL[JP+1]加熱致死的孢子懸浮液混合均勻，經FDA-PI染液染色后，在熒光顯微鏡下可明顯觀察到發出紅色熒光的死孢子和發出綠色熒光的活孢子（圖1-c）。上述結果表明，采用FDA-PI染色方法能較好地對尖孢鐮刀菌孢子的死活進行判斷，其中活孢子呈綠色熒光，死亡孢子呈紅色熒光。

[JP3]由表1可知，在不同濃度（0、1、5、10、50mmol/L）對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌產孢數量有較大區別。其中，對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時產孢數量最多，經血細胞計數器檢測得出，孢子數量為180萬個/mL，其次為含1mmol/L對羥基苯甲酸的培養基，產孢數量為170萬個/mL。對羥基苯甲酸濃度為50mmol/L時不產孢子。經FDA-PI雙染后死孢子在熒光顯微鏡下呈紅色，活孢子呈綠色。在0、1、5、10mmol/L對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌孢子死亡率分別為79%、75%、64%、70%，懸浮液中孢子死亡個數分別為94.8萬、127.5萬、115.2萬、56.0萬個/mL。當對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，尖孢鐮刀菌產孢數量最多，經FDA-PI染色后，孢子存活率也最高。

2.2對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌孢子的萌發率

采用PDA平板法觀察孢子的萌發情況，結果發現，在對羥基苯甲酸濃度為1、5mmol/L的培養基中，孢子萌發最早，萌發時間為5.5h。其次為對照，萌發時間為6h。對羥基苯甲酸濃度為10mmol/L時，萌發時間為11h，而羥基苯甲酸濃度為50mmol/L時，尖孢鐮刀菌孢子無萌發。

由圖2可知，不同濃度對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌孢子的萌發率不同，其中CK組的平均萌發率為42.45%;對羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時，孢子萌發率最高，平均萌發率為58.05%;對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，孢子的萌發率低于濃度為1mmol/L時，平均萌發率為50.8%，對孢子的萌發仍有促進作用，但促進作用減緩;對羥基苯甲酸濃度為10mmol/L時，孢子萌發率低于空白對照組，平均萌發率為29.5%，對孢子的萌發開始有抑制作用;當對羥基苯甲酸濃度50mmol/L時，完全抑制孢子的萌發，孢子平均萌發率為0。

2.3對羥基苯甲酸脅迫下纖維素酶活性的變化

植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質素和壁蛋白等組成。其中，纖維素是構成細胞壁的骨架物質[9]。植物細胞壁是植物健康的保障，病原菌可以通過入侵植物細胞壁，分泌細胞壁降解酶使植物受到侵染而感病[10]。因此，細胞壁降解酶是病原菌侵染寄主組織的主要致病因子之一[11]。由圖3可知，在低濃度的對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加，而高濃度下降低。對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，纖維素酶活性最高，峰值出現在培養4d時，達到1.57U/mL，是相同時間下對照的5.6倍。由此可以得知，低濃度對羥基苯甲酸有利于尖孢鐮刀菌入侵植物組織。

3討論

研究表明，酚酸類物質是導致作物產生連作障礙的主要因素，它可以直接或間接地促進或抑制微生物生長，進而影響作物生長[12]。馬燕會等通過盆栽試驗及高效液相色譜（HPLC）技術發現，對羥基苯甲酸可增加根系分泌物中對鐮刀菌生長具有促進作用的氨基酸種類和含量[13]。甄文超等研究發現，對羥基苯甲酸可提高草莓根際鐮刀菌的數量，致使根際微生物組成由“細菌型”向“真菌型”轉變[14]。在前期研究中，筆者已明確從三七重茬土壤中提取到的29種化感物質對尖孢鐮刀菌具有明顯的化感作用[15]。本研究中，對羥基苯甲酸在低濃度下可增加孢子產孢活性，促進孢子的萌發，最適宜的濃度為5mmol/L，該濃度下，尖孢鐮刀菌產孢數量最高，且通過FDA和PI雙熒光復染法檢測得出，孢子存活率最高，死亡率最低，另外在該濃度下尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性也最高。

熒光素二乙酸酯（fluoresceindiacetate，FDA）可以自由通過細胞膜，被非特異性酯酶分解產生熒光素，并積蓄在活細胞內產生熒光[16]。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）不能透過完整的細胞膜，但能夠透過死細胞的細胞膜而使細胞核被染紅[16]。本研究中，在對羥基苯甲酸脅迫下，利用FDA-PI染色及PDA平板萌發法檢測孢子活性，發現在相同濃度對羥基苯甲酸脅迫下，PDA平板萌發法測定的孢子活性更強。如當對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，PDA平板萌發法測得的孢子平均萌發率為50.8%;而通過FDA-PI染色法得出，活孢子比例為37%，遠低于平板萌發法。這說明FDA-PI染色劑對孢子活性具有一定的抑制作用，但相較于PDA平板萌發法方便、快捷。

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