電噴霧萃取電離質(zhì)譜直接檢測人體呼出氣體中的乙腈

摘要人體呼出氣體攜帶大量的生理病理信息，在臨床診斷和代謝組學研究中發(fā)揮著日益重要的作用。本研究在未對樣品進行預處理條件下，采用電噴霧萃取電離質(zhì)譜（EEIM）技術(shù)直接測定呼出氣體中乙腈分子。在優(yōu)化的實驗條件下，結(jié)合多級串聯(lián)質(zhì)譜，有效地獲得了人體呼出氣體中乙腈含量的信息。對氣相乙腈的檢出限為71pLL，線性范圍為76～191pLL。以兩名健康志愿者呼出氣體為實例，實際檢測了其中乙腈的含量分別為19和1pLL，相對標準偏差（R）分別為6%和72%。結(jié)果表明，本方法靈敏度高、精密度好、分析速度快、特異性強，能夠承受呼出氣體中復雜基體的影響，適合于呼出氣體中痕量乙腈的直接半定量檢測，也可為呼出氣體中其它小分子物質(zhì)的檢測提供新思路。

關(guān)鍵詞電噴霧萃取電離質(zhì)譜；乙腈；呼出氣體

1引言

近年來，呼出氣體檢測憑借其無損、快速、取樣方便等優(yōu)勢，及其中的生物標記物分子與疾病（如肺癌、新陳代謝、臟器狀況的相關(guān)性，逐漸成為現(xiàn)代臨床醫(yī)學、分析檢測領(lǐng)域研究的熱點。有研究表明，乙腈可作為吸煙的標志物，隨著吸煙數(shù)量的增加，吸煙者呼出氣體中乙腈的含量迅速升高，即使是被動吸煙者，其呼出的乙腈含量也明顯高于正常對照組]。據(jù)報道，乙腈還與吸毒成癮、膀胱癌等有一定關(guān)系。因此，建立一種實時在線、靈敏、快速、準確的呼出氣體中乙腈的檢測方法，對乙腈在人體中的代謝及其在人體生理病理中所產(chǎn)生的作用的研究具有重要意義。

乙腈分子檢測的常規(guī)方法有氣相色譜法（G）和氣相色譜質(zhì)譜法（GM）。但因靈敏度低，G及GM法很難對呼出氣體中乙腈進行直接快速原位檢測。選擇離子流動管質(zhì)譜法（electionflowtubemassspectrometryIM）和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應質(zhì)譜法（ProtontransferreactionmassspectrometryPRM）已用于呼出氣體中乙腈的檢測。但IM法需對呼出氣體進行收集和預處理，且靈敏度不高，難以實現(xiàn)乙腈的實時在線分析；而PRM法雖可進行呼吸氣體在線分析，但由于乙腈分子較難質(zhì)子化，對儀器的要求更高。加之，呼出氣體基體成分復雜（含氮、氧、水、揮發(fā)性非揮發(fā)性有機化合物等），受環(huán)境的影響較大，檢測結(jié)果的準確性受到了一定限制。EEIM是一種適合于復雜基體樣品分析的新興離子化技術(shù)，它能將中性樣品和帶電試劑離子分開，并在線完成樣品的萃取和電離，適宜于對樣品進行活體、直接、實時檢測。本研究利用其具有可調(diào)三維空間、方便更換萃取試劑及保證人身安全等優(yōu)點，以硝酸銀為萃取溶劑，在無需樣品預處理條件下直接對呼出氣體中乙腈進行快速質(zhì)譜定性及半定量分析。

2實驗部分

21儀器與試劑

EEI離子源：東華理工大學研制。LQXL增強型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國innigan公司），配有Xcalibur數(shù)據(jù)系統(tǒng)。KQ2型超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；精密電子天平（Mettleroledo公司）。甲醇（色譜純，Khemicals公司）；AgNO（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；乙腈（色譜純，ikmaechnologies公司），水為實驗室自制超純水。用水配制1mgL乙腈標準儲備液。用甲醇配制1mgLAgNO溶液，作為噴霧萃取溶劑。呼出氣體樣品來自健康志愿者。

22實驗方法

以超純水梯度稀釋乙腈標準儲備液至，1，2，，1和2nLL各2mL，分別置于mL干凈、干燥的錐形瓶中。用帶有兩支特氟龍通氣管（內(nèi)徑2mm外徑mm）的橡皮塞密封住盛有標準溶液的錐形瓶，其中一支通入乙腈溶液液面下2cm，該氣管上端連接一個控制閥，以控制惰性氣體（N2）的流速；另一支則位于液面上方，將液面上的空氣（含乙腈分子）通過轉(zhuǎn)子流量計引入EEI離子源，流速為8Lmin。乙腈分子與來自EEI另一通道的試劑Ag+碰撞，形成+離子，進入質(zhì)譜被檢測。

采用氣液轉(zhuǎn)換公式計算引入EEI離子源的乙腈濃度：

2實驗條件

實驗采用正離子檢測模式，質(zhì)量范圍～a；霧化氣（N2）壓力為1MPa；質(zhì)譜離子傳輸管溫度為℃；噴霧電壓為kV；

ollisioninduceddissociationI能量分別為1%和16%，碰撞持續(xù)時間分別為和6ms。其它實驗參數(shù)由系統(tǒng)自動優(yōu)化。需要注意的是，因?qū)嶒灢捎?mgLAgNO甲醇溶液，為防止Ag+對儀器的污染和損傷，噴霧溶劑通道與水平面夾角為9°，溶劑噴霧口與質(zhì)譜口距離為cm；為保證樣品分子最大限度與試劑離子進行碰撞并發(fā)生反應，兩噴霧通道夾角保持12°，樣品噴霧口與質(zhì)譜入口距離為cm，如圖1所示；進行樣品檢測時，為防止呼出氣體中待測物分子冷凝于樣品通道管壁上，采用加熱恒溫裝置，使樣品傳輸管溫度保持在8℃。

結(jié)果與討論

1乙腈標準品的EEIM分析

一級譜圖中還有豐度為%的mz166和168。選擇mz166為母離子進行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子mz18，為母離子丟失一個2O分子（圖2c）；進一步以碎片離子mz18為母離子作三級質(zhì)譜分析，得到離子mz17（圖2c及插圖），即母體繼續(xù)丟失一個N分子。同樣地，對mz168進行分析，確認其為19Ag+結(jié)合2O和N分子得到。

ig2EEIMnspectraofstandardacetonitrilesolution

aEEIM一級質(zhì)譜圖；bmz18及mz1的二級質(zhì)譜圖；cmz166的二級、三級（插圖）質(zhì)譜圖；dmz189的二級、三級（插圖）質(zhì)譜圖。

aEEIMspectrum；bM2spectraofmz18andmz1；cM2Minsetspectraofmz166；dM2Minsetspectraofmz189

2呼出氣體的EEI質(zhì)譜圖

圖呼出氣體中乙腈的EEIMn質(zhì)譜圖

igEEIMnspectraofacetonitrileinhumanexhaledbreath

aEEIM一級質(zhì)譜圖；bmz18及mz1的二級質(zhì)譜圖；cmz19的二級質(zhì)譜圖；dmz17的二級、三級（插圖）質(zhì)譜圖。

aEEIMspectrum；bM2spectraofmz18andmz1；cM2spectrumofmz19；dM2Minsetspectraofmz17

呼出氣體中乙腈的半定量分析

目前，呼出氣體定量分析的準確度主要受制于沒有合適的呼出氣體標準樣品。本研究采用22節(jié)的實驗方法，通過理論計算，將液相中乙腈濃度換算成氣相中乙腈濃度，為氣態(tài)樣品的定量分析提供了一個有效的思路。雖然所使用的乙腈標準樣品與呼吸氣體真實樣品不完全一致，但它仍可為呼出氣體中乙腈檢測提供有效的定量信息。圖乙腈的校準曲線

igalibrationcurveofacetonitrilestandardsolution

1線性范圍、檢出限和精密度實驗配制系列梯度濃度～2nLL的乙腈標準溶液，按上述方法進行實驗。為排除假陽性信號，選擇mz18（＼[17Ag+N＼]+）的二級特征碎片離子mz17（Ag+）進行定量分析，同時扣除相應的背景。每個濃度的標準樣品測定7次，以其凈響應信號強度平均值與對應的氣相乙腈濃度繪制標準對數(shù)曲線（圖）。實驗表明，氣相乙腈濃度在76～191pLL范圍內(nèi)，離子強度與濃度具有較好的線性關(guān)系。線性回歸方程為logI=922logcg+6，相關(guān)系數(shù)R=999。

對nLL標準樣品平行測定1次，精密度（R）為%，氣相乙腈的檢出限（LO，N=，根據(jù)LO=cσ進行計算）為71pLL。可見，本方法靈敏度高、檢出限低、精密度好，適合于痕量乙腈的半定量檢測。

2呼出氣體中乙腈含量分析兩名無吸煙習慣的健康志愿者，年齡分別為2和26歲。志愿者早晨（約8∶am）空腹狀態(tài)下的呼出氣體通過特氟龍管引入EEI源，呼出氣體流量約為8Lmin，得到二級特征信號mz17的凈響應信號強度。每名志愿者呼氣1次，每次持續(xù)1～1s。通過校準曲線，由線性回歸方程計算得呼出氣體中乙腈含量。取1次測量平均值，所檢測兩名志愿者呼出氣體中乙腈含量分別為19和1pLL，R為6%和72%。圖午餐前后6名志愿者呼出氣體中乙腈含量變化

igChangeofacetonitrileconcentrationinbreathbeforeandafterlunchforsixvolunteers實驗表明，本方法分析速度快、特異性強、精密度好，適宜于人體呼出氣體中痕量乙腈的檢測。