綿羊冷凍精液稀釋液成分的研究進展

（寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750000）

隨著我國農牧業的發展，養羊業已經成為我國一項重要的產業，但是我國綿羊品種良種化程度較低，生產力水平不夠，應建立健全良種繁育體系，適應現代養羊業發展的需要。我國自60年代以來，對綿羊冷凍精液的研究和應用都取得了較大的進步，綿羊的人工授精是我國養羊業生產中常用的技術之一，利用人工授精可以擴大優良綿羊品種的利用率、減少引種費用和飼喂種公羊的費用，而且還可以提高母羊的受胎率。稀釋液成分對精子有良好的保護作用，可以防止低溫對精子的危害、具有提供緩沖物質、供能、抑制細菌生長等作用。近年來，為了提高綿羊精液的冷凍品質以及冷凍效果，許多研究者在稀釋液成分方面研究日益增多。本文對國內外綿羊精液稀釋液相關成分研究進展進行綜述。

1 抗凍保護劑

精液的冷凍是指精液保存在液氮（-196℃）或者干冰（-79℃）的超低溫條件下，使精子的代謝幾乎停止，處于休眠狀態。為了防止超低溫對精子的傷害，抗凍保護劑可以使精子在低溫冷凍時保護精子，延長精子的存活時間。抗凍保護劑根據細胞膜的通透性可分為高膜透過性和低膜透過性兩種類型。在沒有防凍劑的情況下，精子在凍融過程會發生精細胞脫水、細胞膜結構損傷、蛋白質變性等危害，探索良好的抗凍保護劑非常重要。常見的抗凍劑有卵黃、甘油、乙二醇、二甲亞砜、肌醇、有機鹽以及一些糖類等。

1.1 高膜透過性防凍劑

目前在綿羊精液中添加的膜透過性較高防凍劑種類較多，主要以甘油、乙二醇、酰胺類物質為主。甘油作為一種通透性很強的保護劑，是綿羊精液最早使用的抗凍保護劑，一般濃度為4%～6%，其在精液中可以降低細胞內溶質的濃度，阻止精子細胞蛋白質的變性。甘油進入細胞內外，可以減緩細胞的脫水速度，避免精子細胞發生滲透性損傷，但甘油會損傷精子的結構并影響一些酶的活性[1-5]。在篩選比較甘油、乙二醇、乙酰胺對公羊精液的保存效果時發現，5%甘油比其他冷凍保護劑的質膜完整性更高，甘油（5%）和乙二醇（3%或5%）的聯合使用，可以使精子運動能力更大，并且研究發現5%甘油對精子質膜可以提供更好的保護[6]。劉玉峰等[7]發現用濃度為5%的乙二醇冷凍綿羊精液可以提高凍后精子的頂體完整率，其冷凍效果優于甘油。但研究也表明用乙二醇作為豬精液的冷凍保護劑，導致精液尾部畸形精子較多，可能對精子也有一定的損害作用[8]。精子經過冷凍后細胞結構的完整性至關重要，研究發現十二烷基硫酸鈉（SDS）可以保護精子膜結構，能夠保護精子的頂體與質膜的完整率[9]。同時宋玉坤等[10]發現在綿羊冷凍精液中添加1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）可以顯著提高冷凍解凍后精子的成活率。曹訪等[11]對不同冷凍保護劑（乙二醇甲醚、乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇、甲醇、二甲基亞砜等）進行篩選發現，乙二醇與丙三醇對精液的冷凍保存效果最佳。在缺乏蛋黃的山羊精液中添加二丁基羥基甲苯（BHT）可以提高冷藏精液的活力，以及凍融精子的活力（48.5%）和受精能力（62.5%），所以二丁基羥基甲苯可以代替來自動物源性的蛋黃，減少某些疾病的傳播[12]。

1.2 低膜透過性防凍劑

低膜透過性防凍劑不但不需要添加基礎液，還可以起到調節滲透壓的作用，常見的有蔗糖、乳糖、麥芽糖、肌醇、抗壞血酸鈉以及TEST液等。卵黃作為非滲透性的防凍劑，因為其含有卵固醇，早期研究發現它可保護精子免受冷休克的破壞作用，保持精子的活力，減少頂體酶的損失[13]，蛋黃可以降低甘油的濃度，減少甘油對精子的損傷，是稀釋液中常加的一種物質。毛冉等[14]通過比較不同糖類（葡萄糖、D-半乳糖、果糖和蔗糖）對綿羊精液的保存效果，發現葡萄糖、D-半乳糖和果糖的混合糖效果較好，蔗糖組效果較差。海藻糖是一種非滲透性的二糖，容易形成氫鍵，可以降低水分子的轉動速度，避免生物膜的脫水損傷，研究發現在精液中添加海藻糖可以減少冰晶對細胞的傷害[15,16]。隨著科學技術的發展，近年來一些無動物源性的抗凍保護劑逐漸被開發，如用大豆卵磷脂替代卵黃，能夠延長綿羊精液低溫保存的時間，以及一些其他植物的提取成分也可以作為抗凍劑，且效果明顯[17-20]。

2 抗氧化劑

活性氧對維持精子正常的生理功能至關重要。一般在精液中添加的抗氧化劑有維生素、氨基酸、酶、植物提取物等，這些抗氧化劑的機理大部分是與自由基的結合，形成抗氧化成分，以保護精子。公羊精子在體外也具有抗氧化防御系統，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶，以及非酶抗氧化劑等。在酶的作用下，精子在體外可以減少氧化[21]。

2.1 維生素族抗氧化劑

抗壞血酸作為一種常用的抗氧化劑，它可能通過防止對精子DNA的氧化損傷來維持精子細胞的遺傳完整性[22]。維生素B12是另一種水溶性維生素，它以輔酶的形式參與各種代謝過程，維生素B復合物可以提高精液解凍后的活力，并在冷凍保存過程中保護精子膜的完整性[23]。同樣Hu等[24]發現維生素B12可以保護精子在冷凍過程中免受膜脂質的過氧化作用，所以在精液冷凍過程中，可以添加B12 能減少精子在冷凍過程中的損傷，從而提高精子的活力。維生素E是一種親脂性抗氧化劑，可保護組織中的多不飽和脂肪酸免于過氧化，在冷凍精液中添加維生素E可改善精液的活力和精子膜完整性[25,26]。

2.2 酶與氨基酸類抗氧化劑

部分酶類在精液中可以起到很好的抗氧化作用，如超氧化物歧化酶（SOD）可以保護頂體的完整性，增強線粒體的活性，以期延緩精子的壽命[27]。過氧化氫酶已被用于抗氧化劑運用在綿羊精液當中，以提高精液的抗氧化能力并保持精子功能[28]。研究發現在冰凍融化的公羊精液中，添加谷胱甘肽可以提高精子的活力，增加谷胱甘肽過氧化物酶的活性[29]。

氨基酸類抗氧化劑也存在于精漿當中，常見的有脯氨酸、牛磺酸、亞牛磺酸、組氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、半胱氨酸等。脯氨酸可以減少脂質的過氧化作用，并能夠穿透精子，從而抑制細胞內冰的形成，Sharon等[30]將谷氨酰胺和脯氨酸作為冷凍精液的抗氧化劑加入到精液中，發現可以防止冷凍對精子的傷害并改善冷凍前后的精子的性狀。蛋氨酸是谷胱甘肽的前體氨基酸，可保護細胞免受氧化損傷，蛋氨酸與棉子糖共同使用可以防止冷凍對精子DNA的損傷[31]。半胱氨酸容易穿透細胞膜，增強了細胞內谷胱甘肽的合成，防止在精液儲存或冷凍狀態下精子喪失運動性，在精液中添加半胱氨酸和牛磺酸可以提高精子頂體和整體形態的完整性、增加精液的抗氧化力[32]。褪黑素是色氨酸的衍生物，它通過與自由基的結合并通過一系列過程形成抗氧化成分，增加一些抗氧化酶類的活性、提高精子DNA的完整性、保護頂體的完整性等優點，常添加在精液中作為一種抗氧化劑[33-35]。

2.3 植物提取物抗氧化劑

近年來，研究者從植物中提取有效成分用來作抗氧化劑，并起到了很好的效果。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚類復合物，其可以參與精液的氧化還原調節，自身可以產生抗逆性的物質，研究發現白藜蘆醇可以提高家畜凍精的品質[36,37]，呂春榮等[38]發現在山羊冷凍稀釋液中添加適量濃度的白藜蘆醇可以改善山羊凍精質量。從大豆植物中提取的大豆異黃酮，因為其含有酚羥基，可以與自由基結合，從而抑制氧化，研究發現在種公羊精液稀釋液中（常溫）添加0.10 mmol/L的大豆異黃酮可提高精液保存效果[39]。吳琳[40]發現在豬常溫精液中添加抗氧化劑丹參酮IIA、蘆丁和靈芝多糖顯著增強精子的活率，且顯著促進精子的抗氧化酶能力，降低了脂質過氧化反應的發生。李宇[41]發現在山羊精液中添加中藥抗氧化劑提取物3.0 mg/ml淫羊藿多糖，可以提高凍融后精子的質量，改善精子的總抗氧化水平，對精液冷凍保存具有保護作用。沒食子酸是一種天然抗氧化劑，研究發現在精液中添加它可以顯著提高后精子的活率，并降低精液中活性氧以及脂質過氧化產物的含量[42]。鞣花酸屬于多酚二內酯的一種，它能夠通過清除精子細胞內的自由基，提高總抗氧化能力，減低精子的損傷[43]。椰子油里含有多種抗氧化劑成分，研究發現在Tris基礎液中添加8%的椰子油與不同濃度的蛋黃結合使用可以提高牛精液的冷凍保存效果[44]。

2.4 其他抗氧化劑

精子的氧化損傷是凍融精子活力下降的主要原因之一，二丁基羥基甲苯（BHT）作為抗氧劑經常作食品添加劑，能延遲食物的酸敗，研究發現在冷凍精液中添加BHT可以改善精子的運動能力和存活能力，增加頂體的完整性[45]。M Eslam[46]等發現添加棕櫚油酸酯可改善綿羊精液在儲存過程中精子的活性，提高總抗氧化劑活性水平，所以棕櫚油酸酯可以作為公羊精液在存儲中的抗氧化劑。尿酸鹽是動物精液中的主要抗氧化劑之一，在精液中添加它可以中和自由基，保持一些酶的活性，有助于保存和增強精子的活力，保持其形態，但過量的尿酸鹽能降低精液中一些酶的活性[47]。

3 維持滲透壓物質

滲透壓對精子有很大的影響，精子與周圍的環境基本是等滲的，如果精清部分的鹽類物質濃度過高，則會導致精子脫水，反之，會導致精子膨脹，造成精子運動變慢，甚至死亡。冷凍保存會影響精子的滲透耐受性和細胞內離子濃度[48]，所以良好的滲透壓物質能平衡精子內外滲透壓，以保護精子的正常形態。常見的維持滲透壓物質有糖類和鹽類，其中糖類物質有葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖等，糖類物質不但可以調節精液的滲透壓，還可以為精子提供能源物質，使其保持活力。鹽類物質有檸檬酸鹽、重碳酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等，不但可以調節精液的滲透壓，還可以穩定精液的pH值。國內外主要以Tris為緩沖物質，效果良好，且對精子損傷較小。環糊精是直鏈淀粉轉化而來，其可以降低揮發性的作用，研究發現用環糊精處理山羊精液會增加精子膽固醇含量，不但可以提高解凍后精子的活力和頂體完整性，還可以提高精液的滲透耐受性[49]。

4 抗菌物質

精液本身或者在采精、精液稀釋以及人工授精的同時，會受到細菌或有害微生物的污染，常見的細菌有沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬等。精液中添加抗菌藥物，可控制細菌的污染和生長，提高精子的活力，且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果越明顯[50]。常見的抗菌藥物有鏈霉素、青霉素、林可霉素、慶大霉素、土霉素等，該制菌物質一般屬于廣譜抗生素，對精子的損傷很小。精液中的微生物可以使精子質膜的超微結構發生損傷，影響受精率[51]。茆達干等[27]為了篩選較好的抗菌藥物，在山羊精液中分別添加恩諾沙星、慶大霉素、氧氟沙星、青鏈霉素菌特靈等，結果發現在精液中添加 50 μg/ml的恩諾沙星的低溫保存效果優于其他抗生素。但長期抗生素會增強抗生素的耐藥性，會進一步增加細菌的感染性。近年來，國內外都在尋找可以代替抗生物的最佳替代品，如一些植物提取物、人工合成物等。淫羊藿苷是一種中草藥提取物，其不但有抗氧化的作用，研究發現其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有一定的抑菌作用，且效果與慶大霉素相似[52]。國內研究發現中草藥提取物綠原酸、石榴提取物安石榴甙、Lε-聚賴氨酸都可以抑制精液中細菌，對精液有一定的保護作用[53-55]。

5 小結與展望

隨著畜牧業的發展，科技工作者為了提高綿羊冷凍精液的保存品質，在稀釋液中添加了種類繁多的添加物，以期找到更好地添加劑。人工授精技術為是綿羊的改良的一項重大革新，為畜牧生產提供了便捷，而冷凍精液可長期保存，運輸簡易，且生物安全系數高。稀釋液是精子的保護劑，可以減少精子在冷凍過程中的損傷，部分稀釋液成分因動物的種類的不同其效果也有差異，起作用效果機制還不太明確。目前研究主要集中在尋找具有多種性能的添加劑并探究其作用機制，如一些糖類不但可以提供能源，還能起到防凍作用，一些植物的提取物也有良好的效果，以及用一些無動物源性的添加劑來代替卵黃，減少某些疾病的傳播。所以加強精液冷凍技術在生產實踐中的使用，會為羊業生產帶來更多的效益，而稀釋液的種類、品質、技術也會進一步提升。