干細胞誘導分化為視網膜色素上皮細胞的途徑探討

陳 瑾，徐國興

0引言

干細胞(stem cell)是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。它可以分化成多種功能細胞，具有經培養不定期地分化并產生特化細胞的能力。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)和成體干細胞(somatic stem cell)。越來越多的證據表明，當成體干細胞被移植入受體中，它們表現出很強的可塑性[1]。1999年有學者分離出小鼠的肌肉干細胞，體外培養5d后，與少量的骨髓間質細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結果發現肌肉干細胞會分化為各種血細胞系[2]。這種現象被稱為干細胞的橫向分化(trans-differentiation)[3]。關于橫向分化的調控機制還不清楚。大多數觀點認為干細胞的分化與微環境密切相關。成體干細胞可以橫向分化為其他類型的細胞和組織，為干細胞的廣泛應用提供了基礎。ES、成體干細胞能夠被定向誘導分化成視網膜色素上皮細胞[4-6]、感光細胞等，由此可獲得轉分化的大量視網膜色素上皮細胞源，體內干細胞及視網膜色素上皮細胞移植有望應用于各種視網膜退行性疾病的細胞替代治療。本文就各種干細胞誘導分化為視網膜色素上皮細胞的途徑及應用進行探討。

1視網膜色素上皮細胞的生理與臨床

視網膜色素上皮是神經視網膜和脈絡膜之間含有黑色素的上皮細胞層，為單細胞層。其生理功能：吸收散射光線；控制視網膜下腔的液體和營養物質；視色素再生與合成；合成生長因子和其他代謝物；維持視網膜的貼附；胞飲和消化光感受器的代謝廢物；維持電穩態；創傷和手術后的再生和修復。臨床上許多視網膜疾病所發生的色素改變都發生在色素上皮層[7]。

視網膜變性等疾病如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)以及青光眼等，將導致視覺功能的損傷，尤其是視細胞的丟失將導致視覺功能的永久喪失。目前各種治療方法尚無明確療效，收效甚微。近年來，基因和干細胞研究取得了長足的進步，學者們將研究重點放在了視網膜細胞的移植上，特別是視細胞和視網膜色素上皮，為上述疾病的治療提供了可能。基因治療技術在眼科取得了巨大的進展,干細胞的發現為科學家們開辟了一條全新的道路。干細胞具有多向分化的潛能，故有望通過特定的體內外誘導干細胞分化為視網膜色素上皮細胞的方法，為視網膜色素上皮退行性病變提供有效的細胞替代治療手段，將有功能的細胞代替損傷的細胞，從而恢復其功能。通過視網膜干細胞移植,使其整合入視網膜各層并且分化為目標細胞,以重建視網膜功能[8]。

2干細胞誘導分化為視網膜色素上皮細胞的途徑

2.1 ES誘導分化為視網膜色素上皮細胞1998年,Thomson等[9]和Gearhart等[10]分別用ES和胚胎生殖細胞建立了人的ES系,在體細胞與生殖細胞間架起了橋梁,為研究ES的發育,在體外培養人體細胞和組織,利用ES治療疾病提供了廣闊的發展前景。

ES來源于囊胚期胚胎內細胞團，具有無限增殖、多向分化等特性，研究者們通過創造特定的體外培養條件，可將ES定向誘導分化成視網膜色素上皮細胞，已有大量研究成果證實這一方法的可行性，成功誘導出視網膜色素上皮細胞[11-15]，并有望成為視網膜退行性病變替代治療的細胞首選獲取途徑。

2.2成體干細胞誘導分化為視網膜色素上皮細胞成體干細胞是存在于人與哺乳動物已分化組織與器官中，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的尚未分化的不成熟細胞群體。在適當的誘導條件下，可分化出組成該器官組織的各種細胞類型，替代生理性衰亡細胞在組織受損時起代償性增生作用，維持機體的正常結構和功能。在體外可跨系、甚至跨胚系分化為某些成熟細胞。與ES相比，成體干細胞在應用上有更大的優勢[16]：(1)存在于人體各種組織和器官中，取材方便，不涉及倫理問題。(2)正常情況下處于靜止狀態，只有在病理情況下才顯示出一定的自我更新潛能，其導致細胞“永生化”甚至癌變的可能性較小。(3)可產生一個含有多種細胞成分的特定組織，移植入患者體內后，有望產生該器官所有類型的目標細胞，達到在結構和功能上的修復或替代。(4)一些類型的成體干細胞可向體內損傷甚至遠離其發源地的部位遷移，成為前體細胞并分化為終末成熟細胞，用來修復組織損傷。也可將其作為目的基因的理想載體。(5)某些成體干細胞可分泌生長因子，發揮動員或保護該組織其他細胞的作用以加強移植效果。人們可以利用基因工程手段對成體干細胞進行操作，以補充患者組織中缺乏的某些成分。

成體干細胞數量很少，其基本功能是參與組織更新，創傷修復及維持機體內環境穩定。研究結果表明，即使在含量豐富的骨髓細胞，每10000～15000個骨髓細胞中只有一個造血干細胞[17]，人和動物皮膚中的干細胞含量僅為7%～8%[18]。目前發現能誘導分化為視網膜色素上皮細胞的成體干細胞主要包括骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、脂肪干細胞等。

2.2.1 MSCs誘導分化為視網膜色素上皮細胞成人的MSCs主要來源于骨髓，具有多向分化潛能，可作為誘導分化視網膜色素上皮細胞的種子細胞[19-20]。 MSCs不表達造血干細胞表面抗原CD34、CD14及白細胞表面抗原CD45，而表達SH2、SH3、CD29、CD106和CD166等表面抗原[21]。血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)作為結締組織生長因子，對體外MSCs生長有促進作用[22]。在合適的條件下，MSCs易誘導分化為間充質組織細胞如成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、造血干細胞等。已有研究表明，大鼠MSCs可在體外成功誘導分化為視網膜色素上皮細胞[23]。

MSCs誘導分化為視網膜色素上皮細胞可通過眼內注入法和體外誘導法來實現。(1)眼內直接注入法：有研究表明，將MSCs直接注入RCS大鼠視網膜下，MSCs能與視網膜色素上皮層及視網膜神經層整合[24-28]，并能表達視網膜色素上皮特征性標志物，如細胞角蛋白(cytokeratin，CK)與S-100[29]。誘導分化而來的視網膜色素上皮細胞可挽救部分病變的視網膜色素上皮細胞和視網膜神經細胞[30]。另有學者通過向患有視網膜色素變性RCS大鼠的鼠尾靜脈注射MSCs[31]，注入的細胞可遷移至視網膜神經上皮層，此法相對無創，可減少高眼壓、眼內炎等風險，并能延緩視力喪失。通過眼內直接注入法雖能使誘導的視網膜色素上皮細胞表達相關標記物，且能夠遷移至視網膜色素上皮層，但由于分化的細胞缺乏視網膜色素上皮細胞典型形態及細胞功能，其療效尚待進一步觀察。(2)體外誘導法：為使誘導分化的視網膜色素上皮細胞能夠獲得正常視網膜色素上皮細胞的典型形態及細胞功能，近年來，學者們對體外誘導分化系統進行了大量的研究和探索，包括與視網膜色素上皮細胞共培養進行聯合誘導[32-33]，或添加誘導劑[34-36]進行誘導。2013年，Duan 等[32]利用Transwell膜隔離培養豬視網膜色素上皮和人MSCs，共培養14d后骨髓干細胞內出現色素顆粒，并表達視網膜色素上皮細胞標記物，具有吞噬功能和一定的分泌功能。盡管體外誘導法取得了一定的成果，但誘導分化的細胞僅具備正常視網膜色素上皮細胞的部分功能，目前尚存在誘導率低，移植后存活率低等問題。

2.2.2脂肪干細胞誘導分化為視網膜色素上皮細胞來源于不同部位的脂肪干細胞的數量和分化潛能不同，白色脂肪內的含量多于棕色脂肪，而與腹部、大腿和乳房來源的脂肪組織相比，人的前臂組織中含有更多的脂肪干細胞。用不同的誘導方法可以跨胚層定向分化形成軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、血管內皮細胞、神經元細胞，肝細胞、上皮細胞、視網膜色素上皮細胞等。與來自骨髓的間充質干細胞不同，脂肪干細胞的分化能力不會隨著提供者年齡的增加而降低。迄今為止，脂肪干細胞體外誘導為視網膜視網膜色素上皮細胞方法主要還是采用體外誘導，包括與視網膜色素上皮細胞共培養或聯合光細胞感受器進行誘導，或添加誘導劑進行誘導[37-38]，誘導劑含有各種生長因子，如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、視黃酸和牛黃酸 、胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ, IGF-Ⅰ)、轉化生長因子 (transforming growth factor, TGF)、PDGF等,這些生長因子培養液制備成脂肪干細胞的誘導液,聯合誘導劑的應用,可以創造一個更好的細胞誘導微環境。研究證實了脂肪干細胞可以體外誘導分化為視網膜色素上皮和光感受器細胞，但脂肪干細胞誘導分化為視網膜色素上皮不能做到充分的分化，誘導出來的細胞功能也與正常成熟的細胞存在差異。Rezanejad等[37]研究發現脂肪干細胞僅能誘導分化出少量的視網膜色素上皮細胞，且不具有正常細胞的形態功能。脂肪干細胞對視網膜退行性疾病的細胞替代治療方面具有巨大潛力。

3小結與展望

ES是細胞的源頭,具有多向分化功能或全能性,并能夠定向分化為視網膜色素上皮細胞,因此在視網膜退行性疾病的細胞替代治療方面前景廣闊。但它存在著取材不便、移植免疫排斥的限制和倫理學方面的困擾。而成體干細胞只能在體外有限誘導擴增為視網膜色素上皮細胞,通過體外的擴增培養雖能夠提高轉化效率, 然而體外轉化是否會引起干細胞遺傳特性的改變尚不清楚，但這類干細胞存在于宿主體內,可直接從患者自身獲得,故無移植免疫排斥的限制也無倫理學方面的困擾。

干細胞誘導分化為視網膜色素上皮細胞的研究目前尚處于實驗階段，雖然取得了一定的成果，為一些視網膜退行性病變如視網膜色素變性等疾病的替代治療帶來希望，但同時應認識到在干細胞實驗研究中出現的一些問題，如誘導多能干細胞分化的機制尚未完全明確；多能干細胞在誘導分化中可導致組織瘤變風險；移植后的免疫排斥問題；可能導致早衰等。

細胞移植是治療視網膜色素上皮細胞變性疾病最具前景的方法，但是如何獲得經干細胞誘導分化，數量充足且低免疫排斥和低成瘤風險的視網膜色素上皮細胞是目前細胞治療視網膜色素上皮變性疾病的所面臨的主要問題。隨著干細胞組織工程的研究進一步發展，干細胞細胞移植將為視網膜色素上皮變性疾病等致盲性眼病的治療開辟新的途徑。