誘導胚胎干細胞分化為視網膜色素上皮細胞的培養方法

張 格，朱 涵, 張婧雯，徐雨迪，段銘煊, 張 戈

0引言

視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)位于視網膜光感受器和脈絡膜毛細血管網絡之間,功能多樣，在促進視網膜及其光感受器的功能中起著多種作用[1],成熟RPE細胞不具再生能力，RPE細胞的壞死、凋亡等功能異常是引起視網膜變性疾病的主要原因。視網膜變性類疾病主要包括年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、視網膜劈裂癥、視網膜脫落、黃斑水腫、視網膜黃斑衰退癥、遺傳性黃斑營養不良等，臨床上前兩者較普遍[2]。ARMD是老年人致盲最主要的原因，此病的發病率日益增多，60歲以上人群發病率達1/10，成為眼科防盲研究的重點課題。RP是一組以進行性光感細胞及色素上皮功能喪失為共同表現的遺傳性疾病，是遺傳性視覺損害和失明的最常見原因。目前這類疾病在臨床上以支持療法為主,仍無有效延緩或逆轉病程的方法。胚胎干細胞(ESCs)是從胎兒組織中的原始生殖細胞或哺乳動物囊胚內層細胞群或經體外分離，抑制分化培養得到的能無限增生、自我更新及具備多向分化潛能的細胞。應用具有無限種子細胞資源的ESCs誘導分化出的RPE細胞，進行體內細胞移植治療，可補充損傷的視網膜色素上皮細胞，恢復視網膜功能，有望為臨床治療視網膜變性疾病帶來希望。目前對于ESCs治療視網膜變性疾病的研究較多，培養分化方法不斷創新，本文旨在收集ESCs誘導分化RPE的培養方法，歸納總結從不同角度作出綜述。胚眼發育時,細胞具高度可塑性，易被周圍因素影響，在各種信號分子的誘導下,激活細胞內信號通路,使視泡背側前體細胞朝著RPE細胞定向分化[3]，干細胞向體細胞的誘導分化需精準時空調節，RPE的形成與誘導中重要信號通路的正確表達密切相關[4]。

1細胞因子誘導法

將可影響干細胞分化為RPE細胞的細胞因子(小分子化合物)加至培養基，在ESCs不同分化階段選擇性激活或抑制特異性通路[5]，顯著縮短分化時間，提高分化效率，由于無生物源性可避免種間污染和免疫排斥反應[6]。

1.1肝細胞生長因子含肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)的人間充質干細胞的條件培養基在體外促進RPE細胞分化與RPE細胞作為細胞片層的增殖，顯著誘導干細胞向視神經細胞分化。分化細胞顯著表達RPE標志物RAX、PAX6、LHX2和SIX3[7]。HGF具有一定誘導作用，但不能使干細胞徹底分化至RPE，HGF對于干細胞早期向視神經細胞或RPE分化起到導向。HGF在體內是hESCs-RPE細胞正常發育的必要因素，HGF在體外對hESCs-RPE細胞的增殖起促進作用，對于分化的促進沒有增殖作用明顯。

1.2激活素A激活素A(Activin A)作為信號分子,系生長因子(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成員。在分化的1～7d加入Activin A,可顯著提高hESCs分化為RPE的效率，較自發分化所產生的色素集落的數目更多且集落更大[8]，在第50d，黑色素灶比率可高達50.7%。流式分析表明得到的RPE能高表達RPE標記物MITF和RPE65。熒光免疫染色檢測RPE能表達早期發育的OTX2蛋白以及特有BETS1蛋白[9]。采用PCR檢測RPE標記基因,與成熟RPE表達水平相似[10]，Activin A影響RPE的自分泌和旁分泌過程,控制胚眼發育過程中細胞增殖與分化[11]。Activin A還能增強另一種細胞因子煙酰胺(nicotinamide,NIC)誘導分化RPE的作用[12]。除此之外，又可通過特定的信號通路調節RPE遷移[13]。

1.3姜黃素誘導第14d加入姜黃素處理24h，促進細胞增殖并使RPE細胞中的活性氧減少[14]，誘導第3wk便出現肉眼可見的黑色素細胞，第5wk可見大量團塊色素細胞。姜黃素法的細胞色素化的時間、色素化細胞的比例和成熟RPE細胞標志物ZO-1、MITF、Pax 6的表達明顯優于空白對照組[15]。機制在于姜黃素刺激Wnt/β-catenin信號通路，使Wnt通路下游靶因子、受體和配體表達明顯升高。

1.4絲蛋白絲膠絲蛋白絲膠通過刺激NF-κB信號通路上調RPE相關轉錄產物促進黑色素生成，可替代血清，顯著降低感染的風險。用含1%絲蛋白絲膠的DMEM培養基分化12d后即可產生色素，細胞密度與存活率更高，細胞死亡率更小，全流程中均可觀察到Ⅰ期～Ⅳ期的黑色素體。經檢驗RPE相關轉錄產物(RPE65和CRALBP)及相關蛋白(RPE65和黑色素)水平升高[16]。

2二維和三維誘導分化法

ESCs培養基除去堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，并去除小鼠胚胎成纖維細胞飼養層，ESCs可自發向RPE細胞分化，包括二維誘導和三維誘導，其中二維誘導包括連續貼壁培養和形成擬胚體繼續貼壁培養[17]。

2.1二維分化法

2.1.1連續貼壁培養連續貼壁培養使hESCs在去bFGF培養基自發分化形成RPE細胞，人工分離色素繼續貼壁培養，細胞逐漸融合擴大成肉眼可見色素灶，從去除bFGF算起到色素灶可見需1～8wk[17]。純化hESCs-RPE細胞有兩種方法：機械切割法和酶消化分離法，前者是當色素灶擴大至直徑1mm時，用25G眼科手術刀切割色素，消化分離，接種于培養皿中繼續培養；后者通過兩步連續的胰酶消化以分離純化RPE細胞，將第二次消化的RPE細胞接種于培養皿中繼續培養[18-20]。

2.1.2形成擬胚體將hESCs在懸浮培養基中培養成擬胚體在無飼養層基質包被的去bFGF的培養基連續貼壁培養，直至形成色素灶[21-27]。當擴大到能手動分離色素灶時再于培養皿中培養。懸浮培養需1～3wk，開始培養到色素灶肉眼可見需4～8wk[28-32]。

2.2三維分化法hESCs在無血清或生長因子降低的培養基中懸浮培養，或在無血清培養體系中快速聚集成擬胚體，hESCs可以自發形成連續的神經上皮空泡，繼而形成含色素的RPE細胞層[33-34]。三維法除可有效誘導hESCs分化為視網膜前體細胞和似胚胎視杯的杯狀構造物外，所產生的視杯具有正常的RPE結構。第20d出現色素灶，待其進一步擴大至能人工分離，用上述純化法將色素灶挑出，連續貼壁培養。在分化中可觀察到連續的神經上皮樣結構、視杯等。

2.3二維誘導法與三維誘導法比較二維的誘導方法不能模擬體內胚胎發育過程，但三維誘導經歷視杯結構，更接近原代分離的RPE細胞。二維和三維培養的RPE樣細胞均可檢出BEST1+、CRALBP+、RPE65+、PDEF+等RPE標志物[33-34]，當細胞不斷分化，上述物質表達上調，但三維培養的細胞表達均低于同時期二維培養的表達水平，并且差距逐漸縮小，說明三維誘導的細胞比二維誘導細胞更幼稚[35]。三維誘導的RPE與二維相比，色素灶出現晚，色素更少和但壽命更長。

3共培養法

3.1細胞共培養技術此技術是在同一種環境下，共同培養2種或2種以上的細胞，因可更好地模擬體內環境，被廣泛應用。誘導過程中，若將ESCs與原代成體視網膜細胞或胚眙期未成熟的視網膜前體細胞共培養，則會增加分化效率。

3.2細胞外基質與鄰近細胞影響分化將hESCs于小鼠PA6基質細胞上培養2wk可獲得神經前體細胞[36]，再接種到人布魯赫膜或基質膠上進行RPE誘導分化。接種前，hESCs表達高干細胞標志物OCT3/4、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81；在PA6細胞上培養后，形成色素灶并表達β-微管蛋白Ⅲ神經前體標志物；接種在基質膠上的神經前體細胞，21d時高表達RPE標記物ZO-1；接種在布魯赫膜上的神經前體細胞15d出現色素細胞，高表達RPE標記蛋白。綜上，鄰近細胞或細胞外基質能夠沿光感受器或RPE前體細胞系誘導hESCs，使分化后的前體細胞群體富集。

3.3人視網膜微血管內皮細胞影響分化將hESCs-RPE細胞與人血管內皮細胞共培養6wk。結果表明，RPE特異標記物ZO-1在單獨培養和共培養中的表達無統計學差異；共培養對RPE細胞的形態和色素沉著未產生顯著影響，然而誘導分化得到的RPE細胞在屏障特性以及刷狀緣方面的差異具有細胞系特異性[37]。

3.4單核細胞以及血清影響分化將RPE細胞與不同濃度血清及不同數量單核細胞共培養[38-40]。結果表明單核細胞和血清均對RPE細胞的生長分化有明顯促進作用，二者具有協同作用。

若共培養的對象不同，誘導分化的結果不同。但均能獲得相應的RPE細胞。共培養模擬體內視網膜細胞生長環境，在外部環境中建立適合細胞定向分化的條件而影響ESCs分化，但分化效率較低，約為傳統培養的30%。

4生物支架包埋法

細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在體外對視網膜發育十分重要，RPE外環境改變如ECM的變化將對細胞發育產生影響。然而生物支架則模擬天然ECM，包裹并支撐活細胞，具備可加工性、堅固性、相容性、可降解性等優點，使得RPE細胞在植入時較少誘導免疫反應。所以運用合適生物材料及細胞載體支架，模擬RPE細胞在體內發育環境，形成基于視網膜組織工程的治療方案具有良好前景。

4.1海藻酸鹽水凝膠包埋法運用不同的水凝膠(0.5%海藻酸鈉、1%海藻酸鈉、明膠水凝膠)包埋hESCs制備擬胚體。證明0.5%和1%海藻酸鈉均能促進hESCs向RPE分化，與對照組相比，含RPE和視囊泡的擬胚體總數顯著增加。但明膠水凝膠組的擬胚體總數改變不明顯。所以誘導能力方面，海藻酸鈉優于明膠水凝膠[41]。姜黃素/海藻酸鈉凝膠共同包埋與純水凝膠相比，生物相容性好，細胞生長能力增強，ECM形成率高，視網膜功能基因上調，細胞增殖率比純海藻酸鈉水凝膠法提高28%[42]。綜上，提高效率首選姜黃素/海藻酸鈉凝膠共同包埋法。

4.2纖維蛋白凝膠包埋法纖維蛋白水凝膠作為RPE移植的支撐材料，使RPE保持活性，生成具有特征鵝卵石外觀和深色的單層膜，RPE的mRNA和蛋白標記物高表達。分化后期加入纖溶酶即可迅速降解纖維蛋白支持物，獲得完整的RPE單層。該操作方便并且不良反應少[43]。

4.3聚乙二醇/gellan凝膠包埋法gellan凝膠具有良好生物學性狀但作為物理凝膠太脆弱，故與聚乙二醇結合起來，從而具備更好的生物相容性、細胞粘附性和細胞生長能力。結果表明細胞在培養全過程中表現出更強的生長分化能力，RPE標記基因的表達也受到正向影響，最終促進視網膜再生。綜上，聚乙二醇/gellan凝膠可作為視網膜再生的替代物[44]。

5小結與展望

誘導分化技術不斷成熟，但如何同時解決效率、周期、成本的問題仍為目前的爭議。自發誘導法費時長且耗資源。二維培養法不能模擬體內胚胎發育過程，但三維法能在體外使細胞歷經視杯結構發育過程，從而得到更接近原代分離RPE細胞，不過色素灶出現的更晚并且數量減少。細胞因子法直接作用于視網膜細胞分化的信號通路顯著提高分化效率并縮短培養時間，但步驟繁瑣成本高，培養需要多次手工傳代，致細胞老化。共培養法模擬體內視網膜細胞生長環境，創造分化環境影響ESCs的分化，優化培養質量，但效率則明顯下降。

如今，針對視網膜變性疾病多是對癥治療，神經細胞保護藥物以及營養支持用以延緩病程進展，治療并發癥，但無法修復已受損的RPE細胞等，干細胞移植則將特定功能細胞整合入視網膜，重建患者視功能，隨著干細胞分化培養及移植治療的新策略不斷涌現，該方法取得的成果給廣大患者帶來了重見光明的希望。但目前的研究仍存在許多爭議待解決，分化的具體流程能否做到在保證質量與效率的條件下精確至以天為時間單位指導操作步驟；是否需要精確標準來評估細胞功能及免疫排斥問題；胚胎干細胞源自胚胎，相關治療時必然會涉及道德、倫理甚至政治問題；不同干細胞系來源的視網膜細胞存在基因組或表觀遺傳學差異,導致干細胞源性RPE細胞移植的長久有效安全性尚需進一步研究。