miRNA檢測(cè)在結(jié)直腸癌診斷及中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

朱麗， 嚴(yán)晶， 聶煒玨， 孫志廣

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇南京 222100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 222100）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率在歐美國(guó)家居首位，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。近年來，我國(guó)結(jié)直腸癌特別是直腸癌的發(fā)病率和病死率也呈不斷上升趨勢(shì)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在我國(guó)城市和農(nóng)村分別占惡性腫瘤發(fā)病率的第4位和第6位，嚴(yán)重威脅國(guó)民的身心健康[1]。為了降低結(jié)直腸癌的死亡率，尋求早期診斷結(jié)直腸癌的普查手段是十分必要的。

1 結(jié)直腸癌篩查方式概況

結(jié)直腸腺瘤是結(jié)直腸癌的主要癌前病變，尤其是進(jìn)展期腺瘤。大約60%以上的結(jié)直腸癌都是由結(jié)直腸腺瘤演變而來，而由腺瘤發(fā)展至癌需要約6～8年的時(shí)間[2]。

目前結(jié)腸腺瘤及結(jié)直腸癌的篩查方法[1]有：（1）大便潛血試驗(yàn)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）。FOBT是目前應(yīng)用最為廣泛的結(jié)直腸癌篩查方法，盡管FOBT簡(jiǎn)便、安全、經(jīng)濟(jì)，并且在結(jié)直腸癌普查中取得了明顯的成功，但與病理檢測(cè)相比，F(xiàn)OBT易出現(xiàn)假陽(yáng)性。（2）腸鏡、乙狀結(jié)腸鏡檢查。腸鏡、乙狀結(jié)腸鏡檢查是目前診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)果最為可靠，但存在侵入性、費(fèi)用高、檢測(cè)有痛苦、檢測(cè)操作要求高（除需相應(yīng)設(shè)備場(chǎng)所外，檢查醫(yī)生尚需相應(yīng)技術(shù)資質(zhì)要求）、且有可能并發(fā)腸穿孔等不足。這些因素導(dǎo)致患者的依從性低且難以廣泛普及開展。（3）癌胚抗原（CEA、CA-199、CA-724）檢測(cè)。癌胚抗原如CEA、CA-199、CA-724等雖然可用于篩查腫瘤，但是對(duì)結(jié)腸癌沒有特異性，且經(jīng)此檢出的結(jié)直腸癌多屬中晚期，故僅作為診斷的輔助手段。（4）糞便DNA檢測(cè)。DNA檢測(cè)包括DNA突變、DNA完整性、癌癥相關(guān)甲基化分析等。糞便DNA檢測(cè)雖然無創(chuàng)，敏感性和特異度也較理想，但因操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、檢測(cè)成本太高而限制了推廣。（5）糞便免疫化學(xué)法檢測(cè)（fecal immunochemical test FIT）。FIT和FOBT類似，但FIT依賴于抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下消化道的腫瘤出血，比FOBT敏感性和特異性高。不足的是，F(xiàn)IT中使用的抗體的不穩(wěn)定性使它在轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存中容易分解并影響效果[3]。

隨著對(duì)結(jié)直腸癌的分子發(fā)生機(jī)制的深入理解，在腺瘤發(fā)展為腺癌的過程中，許多微小RNA（microRNA或miRNA）表達(dá)出現(xiàn)異常，且miRNA在糞便/血液中有極強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性，因此，miRNAs可作為結(jié)直腸腺瘤—腺癌臨床早期檢測(cè)及診斷結(jié)直腸癌的特異性新型生物標(biāo)志物。目前已有大量研究表明多個(gè)miRNA在診斷結(jié)直腸癌中具有特異性及敏感性[4]，故考慮聯(lián)合多個(gè)miRNA基因檢測(cè)，以提高診斷結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)度。尋找結(jié)直腸腺瘤癌變發(fā)展序列過程中特異表達(dá)的非侵入性分子標(biāo)記物miRNA，以及篩查出與結(jié)直腸腺瘤形成及癌變進(jìn)展相關(guān)的miRNA，將對(duì)防治結(jié)直腸癌具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

2 miRNA標(biāo)志物在結(jié)直腸癌診斷的應(yīng)用

miRNA是一種含有21～23個(gè)堿基的內(nèi)源性單鏈小分子RNA。目前已經(jīng)證實(shí)miRNA廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞內(nèi)，能完全或部分與其靶基因的mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域發(fā)生堿基的配對(duì)，完全匹配的結(jié)合可使靶基因mRNA降解，而不完全匹配的結(jié)合則使靶基因mRNA的翻譯受到抑制，從而誘導(dǎo)靶基因mRNA發(fā)生降解，最終抑制靶基因轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)的進(jìn)程。這些非編碼小分子RNA參與調(diào)控了大約人類基因組中30%的基因表達(dá)，可影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程。miRNA作為一類高度保守的小分子非編碼RNA參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等多個(gè)過程，根據(jù)其調(diào)控的基因不同而發(fā)揮致癌因子作用或抑癌因子作用，其表達(dá)量的變化可作為疾病診斷或預(yù)后的標(biāo)記物。

miRNA的異常表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞的增殖分化具有促進(jìn)作用，可表現(xiàn)為原癌miRNA的表達(dá)上調(diào)和抑癌miRNA的表達(dá)下調(diào)。原癌miRNA主要包括let-7b/g、miR-9、miR-17、miR-20、miR-21、miR-31、 miR-92a、 miR-96、 miR-135、 miR-141、miR-155、miR-205、miR-214、miR-224、miR-372、miR-708等。其中被研究最多的是miR-21，在許多癌病中miR-21都被認(rèn)為是原癌miRNA。在結(jié)直腸癌中miR-21能通過靶向抑癌基因（如PDCD4、 TIAM1、 SPRTY、 PTEN、 TGFBR2、CDC25A等）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。而miR-92a則是通過抑制E-cadherin促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[5]。抑癌miRNA主要包括let-7a、miR-7、miR-18a、miR-26b、miR-27b、miR-34a、miR-101、miR-125、 miR-138、miR-143、miR-144、miR-145、miR-194、miR-195、miR-320a、miR-365、miR-491等。研究較多的miR-143和miR-145通過下調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）起到抑癌作用[6]。

2.1 血清miRNA與腺瘤及其癌變的相關(guān)性 通過檢測(cè)正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸管狀腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤及結(jié)直腸腺癌這一序貫發(fā)生的組織變化系列中miRNA的表達(dá)水平，可用于臨床分析正常結(jié)直腸組織、癌前病變、結(jié)直腸癌中的miRNA表達(dá)差異。

劉揆亮等[7]的研究表明，血清miR-204與miR-193b能成為診斷結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，miR-193b可能在腺瘤—腺癌序列中發(fā)揮抑癌作用。張婷[8]報(bào)道，結(jié)直腸腺瘤患者的miRNA-101在腺瘤組織中的表達(dá)高于腺瘤旁組織，在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織（P＜0.05）。朱林林等[9]證實(shí)在管狀腺瘤中miR-1、miR-9、miR-137、miR-145的表達(dá)均低于瘤旁正常組織，miR-31、miR-135a的表達(dá)均高于瘤旁正常組織，在管狀絨毛狀腺瘤中miR-1、miR-137、miR-145的表達(dá)均低于瘤旁正常組織，miR-9、miR-135a、miR-31的表達(dá)均高于瘤旁正常組織；在結(jié)直腸腺癌組織中miR-1、miR-9、miR-137、miR-145的表達(dá)均低于癌旁正常組織，而miR-31、miR-135a的表達(dá)高于癌旁正常組織。由此認(rèn)為正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌中miRNA存在差異表達(dá)，提示上述miRNA在從正常結(jié)直腸組織到結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸腺瘤到結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用[9]。

范慧娟[10]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-661、miR-591可能成為結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸早期癌的非侵入性候選分子標(biāo)志物，miR-215、miR-193b-3p、miR-302b-3p可能在結(jié)直腸腺瘤癌變中發(fā)揮作用。楊燕楠等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-499-5p的表達(dá)水平在正常結(jié)腸、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌姐織中呈逐漸増高的趨勢(shì)，說明其在結(jié)腸癌的癌變過程中呈動(dòng)態(tài)變化。有研究者報(bào)道m(xù)iR-15a-3p能促進(jìn)腺瘤發(fā)展至結(jié)腸癌[12]。劉華[13]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤病變組織及患者血清中表達(dá)顯著升高（P＜0.001），且miR-21在結(jié)直腸癌組中的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤組（P＜0.05）。

劉華等[14]對(duì)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，簡(jiǎn)稱ROC曲線）的分析結(jié)果顯示：對(duì)于鑒別結(jié)直腸癌與健康者，血清miR-21、miR-146a及二者聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.889、0.791和0.863；鑒別結(jié)直腸腺瘤與健康者，其AUC分別為0.784、0.692和0.761；鑒別結(jié)直腸癌與結(jié)直腸腺瘤者，其AUC分別為0.705、0.820和0.713；結(jié)果提示血清miR-21和miR-146a的差異表達(dá)在結(jié)直腸癌的早期診斷中具有潛在的價(jià)值。 Nu?ez-Sánchez M A 等[15]報(bào)道，結(jié)直腸小管腺瘤組織中的miR-1、miR-9、miR-137和miR-145表達(dá)減少，miR-31和miR-135a表達(dá)增加；結(jié)直腸小管絨毛腺瘤組織中的miR-1、miR-137、miR-145水平下降，miR-9、miR-135a和miR-31水平升高；結(jié)直腸癌組織中的miR-1、miR-9、miR-137和miR-145表達(dá)減少，miR-135a和miR-31表達(dá)增加。結(jié)果提示血清miR-20a和miR-486可作為結(jié)直腸腺瘤患者潛在的無創(chuàng)生物標(biāo)志物。

2.2 糞便miRNA與結(jié)直腸腺瘤及其癌變的相關(guān)性 胡晶晶等[16]報(bào)道，早期的結(jié)直腸癌患者糞便中的miRNA-221表達(dá)上調(diào)，可能參與疾病的發(fā)生，提示糞便miRNA-221有可能成為診斷早期結(jié)直腸癌的無創(chuàng)標(biāo)志物。鐘武等[17]的研究表明，Ⅲ＋Ⅳ期結(jié)直腸癌患者糞便中miRNA-21的表達(dá)水平要高于Ⅰ＋Ⅱ期結(jié)直腸癌患者（P＜0.05），低分化患者高于中高分化者（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）；結(jié)果提示結(jié)直腸癌患者糞便miRNA-21表達(dá)的升高可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，糞便miRNA-21可能成為結(jié)直腸癌潛在的腫瘤標(biāo)記物，為結(jié)直腸癌的早期篩查及診斷提供了新的思路。儲(chǔ)懷祝等[18]對(duì)糞便中miRNA-21表達(dá)用于結(jié)直腸癌診斷的文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)靈敏度欠佳，但特異性較好，而多個(gè)miRNA聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌能夠降低誤診率。王靜[19]的研究表明，聯(lián)合檢測(cè)人血漿及糞便中miR-92a-1表達(dá)水平在結(jié)直腸癌診斷及篩查中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。韋皓棠[20]的研究表明，結(jié)直腸癌患者糞便中miRNA-21、miRNA-31、miRNA-92a、miRNA-143的表達(dá)與健康志愿者糞便中的表達(dá)具有明顯差異，可作為結(jié)直腸癌診斷的潛在腫瘤標(biāo)志物，miRNA-21與miRNA-143的聯(lián)合檢測(cè)有望為結(jié)直腸癌篩查提供一種無創(chuàng)且敏感性與特異性較高的診斷方法。miRNA在糞便中的檢測(cè)效果較少受到糞便性質(zhì)的影響，與糞便中是否有隱血，是否使用抗生素，飲食的種類等均無關(guān)，故糞便中的miRNA聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)直腸癌的篩查中是有一定的前景的。

3 miRNA檢測(cè)結(jié)直腸癌對(duì)中醫(yī)藥研究的意義

《醫(yī)宗金鑒》描述結(jié)直腸癌的病因病機(jī)及病癥表現(xiàn)如下：“此證有內(nèi)外、陰陽(yáng)之別。發(fā)于外者，由醇酒厚味，勤勞辛苦，蘊(yùn)注于肛門，兩旁腫突，形如桃李，大便秘結(jié)，小水短赤，甚者肛門重墜緊閉，下氣不通，刺痛如錐，脈數(shù)有力，多實(shí)多熱，屬陽(yáng)易治，宜服一煎散，通利二便，菩提露搽之；腫痛仍前，不全退者，膿將成也，宜服托里透膿湯；膿脹痛針之；膿出之后，治同潰瘍門。發(fā)于內(nèi)者，兼陰陽(yáng)濕熱，下注肛門，內(nèi)結(jié)臃腫，刺痛如錐，大便虛閉，小水淋漓，寒熱往來，遇夜尤甚，脈數(shù)微細(xì)，為虛為濕，屬陰難治，宜服五灰散，膿毒自然潰出；膿生遲者，服十全大補(bǔ)湯托之，潰后按潰瘍門”。可見，結(jié)直腸癌的中醫(yī)病機(jī)邪實(shí)與正虛同時(shí)存在的，邪實(shí)以痰濕、火熱、癖毒多見，正虛以正氣虧虛為主。

中醫(yī)的痰濕、火熱、癖毒與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的炎癥介質(zhì)類似。腸癌細(xì)胞會(huì)釋放大量炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，而miRNA會(huì)隨著炎癥介質(zhì)含量的變化而發(fā)生相應(yīng)變化[21]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在不同組織、器官、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，其表達(dá)譜存在很大差異，即miRNA的表達(dá)具有時(shí)序特異性與組織特異性，而中醫(yī)的“證”也有即時(shí)性與差異性的特點(diǎn)，在這方面二者有相似的特性[22]。不同中醫(yī)證型患者血清miRNA的表達(dá)不同，若能建立血清miRNA的表達(dá)水平與證型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，則可彌補(bǔ)宏觀辨證的不足，將有助于辨證的客觀性和準(zhǔn)確性，從而指導(dǎo)臨床處方用藥[23]。因此，通過檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血清中miRNA表達(dá)數(shù)值的變化，從而得出結(jié)直腸癌不同證型患者血清miRNA表達(dá)譜，將為臨床上應(yīng)用中藥治療不同證型結(jié)直腸癌患者療效的評(píng)估提供可靠的依據(jù)。

綜合以上分析可知，結(jié)直腸腺瘤或結(jié)直腸癌患者的血清及糞便中均可檢測(cè)出相關(guān)miRNA，以患者血清或糞便miRNA表達(dá)水平并結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化數(shù)值作為結(jié)直腸癌療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物，在臨床過程中將患者分層，實(shí)施個(gè)體化治療，做到科學(xué)、合理、安全的用藥，可提高臨床療效。明確中醫(yī)不同證型患者血清miRNA表達(dá)譜的不同，并將miRNA表達(dá)水平作為中醫(yī)微觀辨證的生物標(biāo)志物，可為實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。