產右旋糖酐腸膜明串珠菌酵培養基的優化

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(1.廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所),中國輕工業甘蔗制糖工程技術研究中心, 廣東省酶制劑與生物催化工程技術研究中心,廣東廣州 510316; 2.廣東工業大學輕工化工學院,廣東廣州 510006)

右旋糖酐(Dextran)是一種由簡單的葡萄糖單元聚合而成的高分子胞外多糖[1-2],它是由某些細菌(如腸膜明串珠菌、鏈球菌、葡糖桿菌及乳酸菌等)轉化蔗糖合成的一種α-葡聚糖[3-4],廣泛應用于醫藥、食品及精細化工等領域[5-7]。由于其糖苷鍵的構象不能被動物和人類所消化,進而選擇性地被腸道益生菌利用,因此常作為益生元用作食品中的添加劑,其無毒、安全等優點使其在食品生產中被用于調理劑、穩定劑及增稠劑,也廣泛用于糖食品的保鮮和防腐,這對于我國的綠色農業發展意義深遠[8-10]。

目前,右旋糖酐的合成主要為微生物發酵法制備獲得。生物發酵法[11-12]是通過明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)分泌的右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖水解合成來實現的,先將蔗糖分解成一個果糖和一個與酶連接的葡萄糖基,隨后將后者轉移到葡聚糖殘基的C3/C6位置或水分子,形成糖鏈[13]。有不少學者通過篩選突變菌株、優化發酵條件(pH、溫度及轉速)來提高菌體的發酵效率;Piyarat等[14]通過補料分批發酵降低發酵液粘度,改善物料傳質性,加快蔗糖轉化速率,從而提高了產物產量。然而,微生物發酵合成右旋糖酐過程中會受到多種物理、化學因素的影響[15-19],如培養液中碳氮源、緩沖鹽離子等。適宜的培養基成分及濃度能夠為菌體生長和酶分泌提供有利條件,是其他發酵調控手段的基礎,因此,對腸膜明串珠菌的發酵培養基進行優化,能夠直接影響其發酵效率。有文獻報道,明串珠菌在糖代謝途徑中,蔗糖一部分被胞外的葡聚糖蔗糖酶催化生成葡聚糖和果糖,另有一部分進入細胞被蔗糖磷酸酶分解為葡萄糖-1-磷酸和果糖,隨后進入菌體的戊糖磷酸代謝途徑,供應菌體生長,兩者相互促進[20],因此,蔗糖的轉化效率直接影響著產物的生成效率。響應面法可獲得各因素水平與響應值的連續關聯模型,因此被廣泛應用于微生物發酵優化[21-24]。

本實驗采用腸膜明串珠菌(CICC-23614),以單因素實驗為基礎,采用Box-Behnken實驗對培養基成分及濃度進行優化,利用響應面分析研究,確定最優的發酵培養基成分及濃度,提高蔗糖轉化率,為該菌定向制備右旋糖酐及其未來的應用提供可靠數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides(CICC-23614) 由廣東省微生物研究所菌種保藏中心保藏;蔗糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 廣州化學試劑廠;廣細菌蛋白胨 廣東環凱微生物科技有限公司。

PR1203分析天平 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;LDZX-30KBS滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;SW-CJ-1CU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;GRJB-5D 5L發酵罐 鎮江格瑞生物工程有限公司:LC-20A高效凝膠色譜儀 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 種子培養基(g/L):蔗糖 130,蛋白胨 2.0,Na2HPO4·12H2O 1.4,KH2PO40.3,121 ℃,滅菌15 min;發酵培養基:各成分同種子培養基,培養基中各成分濃度根據實驗設計調整,121 ℃,滅菌15 min。

菌種活化:將購買的腸膜明串珠菌CICC-23614安剖瓶裝的凍干粉劑用無菌水溶解后,吸菌液在斜面培養基上劃線,靜置于25 ℃恒溫培養培養24～48 h,得到斜面菌種,再用相同方法傳代活化三次,斜面4 ℃保藏待用。

搖瓶種子:用接種環從活化好的斜面菌種挑取兩環菌落接種于裝有100 mL種子培養基的250 mL搖瓶中,于25 ℃、100 r/min搖床培養24 h,得到一級種子液。

發酵培養:以9%的接種量接種于發酵培養基中,于25 ℃、100 r/min搖床培養24 h,HPLC檢測分析,記錄蔗糖殘留濃度,計算蔗糖轉化率。

1.2.2 單因素實驗 均以接種時為轉化起點,在25 ℃、100 r/min搖床培養24 h后取樣分析。

固定蛋白胨、Na2HPO4·12H2O及KH2PO4濃度分別為2.0、1.4、0.3 g/L,考察初始發酵培養基中蔗糖濃度(70、100、130、160、190、210 g/L)對蔗糖轉化率的影響。

固定蔗糖初始濃度、Na2HPO4·12H2O及KH2PO4分別為130、1.4、0.3 g/L,考察發酵培養基中蛋白胨濃度(1、3、5、7、9 g/L)對蔗糖轉化率的影響。

固定蛋白胨、蔗糖初始及KH2PO4分別為2.0、130、0.3 g/L,考察發酵培養基中Na2HPO4·12H2O濃度(0.4、0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 g/L)對蔗糖轉化率的影響。

固定蛋白胨、Na2HPO4·12H2O及蔗糖初始濃度分別為2.0、1.4、130 g/L,考察發酵培養基中KH2PO4濃度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L)對蔗糖轉化率的影響。

1.2.3 響應面試驗 根據Box-Behnken實驗原理,以1.2.2單因素實驗為基礎,以其最佳濃度為0點,以蔗糖轉化率為響應值,設計4因素3水平響應面試驗,對腸膜明串珠菌CICC-23614培養基配方進行優化。各因素的三個水平用-1、0、1進行編碼,如表1所示。利用 Design-expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計,共設計29個試驗,其中24個析因試驗,5個為中心試驗,用以對誤差進行估計。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 指標分析方法

1.2.4.1 標準溶液的配制 將蔗糖干燥至恒重后(精確至萬分之一),用二次蒸餾水配制,配制一系列濃度(0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)的蔗糖溶液,用0.22 μm的水膜過濾頭過濾后取適量注入進樣瓶中,進行HPLC檢測。

1.2.4.2 液相色譜條件 色譜柱為Shodex? SUGAR KS-803 No.H25T0005(300 mm×8.0 mm);流動相:超純水;流速:1.0 mL/min;柱溫:50 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.4.3 蔗糖殘留測定及計算 從種子培養基中取9%的種子液于發酵培養基中,發酵結束后用流動相進行適當稀釋后在液相色譜中對發酵液中殘留蔗糖進行定量分析計算,蔗糖轉化率的計算按照下式計算:

1.3 數據處理

利用Origin 7.5進行數據分析和繪圖,利用Design-Expert 8.0.6進行響應面法試驗設計和結果分析。

2 結果與分析

2.1 蔗糖的標準曲線

蔗糖的標準曲線為Y=(1.26073e-006)X+(-0.0156986),R2=0.9999145,見圖1。

圖1 蔗糖標準曲線Fig.1 Standard curve of sucrose

2.2 單因素實驗結果分析

圖2 蔗糖初始濃度對蔗糖轉化率的影響Fig.2 Effects of sucrose concentration on sucrose conversion rate

2.2.1 蔗糖初始濃度對蔗糖轉化率的影響 由圖2結果可以看出,蔗糖初始濃度為70 g/L時,蔗糖轉化率僅為56.1%;蔗糖初始濃度為100 g/L時,蔗糖轉化率最高,其值為61.7%;隨著培養基中蔗糖初始濃度提高至160 g/L以上時,蔗糖轉化率均低于50%,呈明顯降低趨勢。因為在產物右旋糖酐合成過程中,蔗糖既是酶誘導物,又是酶作用底物,在蔗糖的誘導下腸膜明串珠菌分泌右旋糖酐蔗糖酶,該酶在胞外催化蔗糖合成葡聚糖和果糖,適宜濃度的蔗糖有利于細胞處于最佳生長狀態;相反,蔗糖濃度過高會引起培養基中滲透壓的變化,影響菌體的生長狀況及右旋糖酐蔗糖酶的分泌,進而影響蔗糖的轉化,所以選擇蔗糖起始濃度為100 g/L。

2.2.2 蛋白胨濃度對蔗糖轉化率的影響 腸膜明串珠菌屬于化能異樣型微生物,自身不能合成所需要的營養物質,需要外界提供氮源維持其生長[20]。由圖3可以看出,蛋白胨濃度小于3 g/L時,菌體生長沒有足夠的氮源供給,生長狀態差,菌體分泌的右旋糖酐蔗糖酶少,蔗糖轉化率極低;當蛋白胨濃度為3 g/L時,蔗糖轉化率僅為70%,隨著培養基中蛋白胨濃度的不斷提高,蔗糖轉化率呈上升趨勢,當蛋白胨濃度為5 g/L時,蔗糖轉化率可達90%以上,此時繼續提高蛋白胨濃度蔗糖轉化率基本不變,這可能是因為其他營養物質限制了菌體生長,另外蛋白胨含量過高對菌體也可產生毒副作用,所以選擇的蛋白胨濃度為5.0 g/L。

圖3 蛋白胨濃度對蔗糖轉化率的影響Fig.3 Effects of peptone concentration on sucrose conversion rate

2.2.3 Na2HPO4·12H2O濃度對蔗糖轉化率的影響 無機鹽是微生物生長所需的元素,適量的濃度可以促進菌體的生長,并可起到調節pH的作用。隨著Na2HPO4·12H2O濃度的升高,蔗糖轉化率呈先升高后降低的趨勢,當Na2HPO4·12H2O濃度為0.8 g/L時,蔗糖轉化率最高,為81.00%。由于腸膜明串珠菌的糖代謝特點,在以蔗糖為底物的培養基中,明串珠菌代謝產生乙酸。因為在代謝過程中生成乙酸比生成乙醇可多產生一個ATP,對菌體生長有利。因此,腸膜明串珠菌的生長代謝過程中會不斷有乙酸的積累,pH會隨發酵進行而降低[20,26],而培養基中Na2HPO4·12H2O與KH2PO4的存在形成一個緩沖體系,對培養液起著重要的pH緩沖作用,在Na2HPO4·12H2O濃度為0.8 g/L時最適合蔗糖的轉化。因此,最佳的Na2HPO4·12H2O濃度為0.8 g/L。

圖4 Na2HPO4·12H2O濃度對蔗糖轉化率的影響Fig.4 Effects of Na2HPO4·12H2O concentration on sucrose conversion rate

圖5 KH2PO4濃度對蔗糖轉化率的影響Fig.5 Effects of KH2PO4 concentration on sucrose conversion rate

2.2.4 KH2PO4濃度對蔗糖轉化率的影響 由圖5可知,在實驗研究范圍內,蔗糖轉化率基本變化不大,最佳的KH2PO4濃度為0.3 g/L,蔗糖轉化率為82.92%。原因可能是Na2HPO4·12H2O為1.4 g/L時,與0.3 g/L的KH2PO4形成了一個很好的緩沖體系,可以在一定程度上很好地調節因菌體生長代謝引起的pH變化,使菌體處于較佳的生長狀態,也可延長右旋糖酐蔗糖酶的催化作用,而有利于產物的生成[25];KH2PO4濃度過高,與Na2HPO4·12H2O的緩沖作用失調,不能很好地對培養液pH起到緩沖作用,影響右旋糖酐蔗糖酶的分泌,從而降低蔗糖轉化效率。因此,選擇的KH2PO4濃度為0.3 g/L。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1 Box-Behnken試驗設計及結果 根據Box-Behnken試驗原理,以單因素實驗為基礎,以其最佳濃度為0點,以蔗糖轉化率為響應值,

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiment

設計4因素3水平響應面試驗,對腸膜明串珠菌CICC-23614培養基配方進行優化。各因素的三個水平用-1、0、1進行編碼,如表2所示。

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design-expert 8.0.6軟件對表2數據進行數據分析和二次回歸擬合,用Y表示蔗糖轉化率,得到的回歸方程為:Y=89.56-8.33A+5.68B+16.49C+0.37D+5.35AB+6.98AC+0.43AD+1.00BC+1.03BD+0.25CD-1.95A2-4.06B2-13.64C2-3.28D2,R2=0.9864,其方差分析如表3所示。

由表3可知,模型P值<0.0001,說明二次回歸模型極顯著,失擬項P值(0.1017>0.05),差異不顯著,說明此二次回歸模型能夠較好地反映響應值的變化,模型與實際試驗擬合度好,可以很好地對蔗糖轉化率進行分析和預測。一次項A、B、C以及交互項AB、AC,二次項B2、C2以及D2對蔗糖轉化率有極顯著影響(P<0.01)。

圖6～圖11為根據回歸方程繪制的試驗因素間交互效應三維立體響應曲面和等高線圖,可以直觀地考察某兩個因素固定的情況下,其他兩個因素對蔗糖轉化率的影響。由圖可知,蔗糖濃度和蛋白胨濃度(AB)、蔗糖濃度和Na2HPO4·12H2O濃度(AC)的交互作用對蔗糖轉化率有顯著影響,其他交互作用不顯著,與方差分析結果一致。

表3 方差分析Table 3 ANOVA analysis

注:**表示極顯著(P<0.01),*表示顯著(P<0.05)。

圖6 蔗糖濃度和蛋白胨濃度對蔗糖轉化率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour of effects of sucrose concentration and peptone concentration on sucrose conversion rate

圖7 蔗糖濃度和Na2HPO4·12H2O濃度對蔗糖轉化率影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour of effects of sucrose concentration and Na2HPO4·12H2O concentration on sucrose conversion rate

圖8 蔗糖濃度和KH2PO4濃度對蔗糖轉化率影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface and contour of effects of sucrose concentration and KH2PO4 concentration on sucrose conversion rate

圖9 Na2HPO4·12H2O濃度和蛋白胨濃度對蔗糖轉化率影響的響應面和等高線Fig.9 Response surface and contour of effects of Na2HPO4·12H2O concentration and peptone concentration on sucrose conversion rate

圖10 蛋白胨濃度和KH2PO4濃度對蔗糖轉化率影響的響應面和等高線Fig.10 Response surface and contour of effects of peptone concentration and KH2PO4 concentration on sucrose conversion rate

圖11 Na2HPO4·12H2O濃度和KH2PO4濃度對蔗糖轉化率影響的響應面和等高線Fig.11 Response surface and contour of effects of Na2HPO4·12H2O concentration and KH2PO4 concentration on sucrose conversion rate

2.3.3 驗證實驗 根據回歸模型,通過軟件分析,并且考慮到發酵效率及產物純化問題,得到上述4因子的最優添加量為蔗糖101.31 g/L,細菌蛋白胨5.66 g/L,Na2HPO4·12H2O 1.11 g/L和KH2PO40.15 g/L,預測值是93.90%。在此條件下,進行平行驗證,優化培養基培養獲得的蔗糖轉化率與預測值吻合良好,可達91.9%,與預測值誤差僅為2.13%,說明該回歸模型是科學合理的,且優化后的培養基發酵結果為原始培養基(56.35%±0.35%)條件下的1.6倍。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,采用響應面法考察碳源、氮源以及無機鹽對蔗糖轉化率的影響。結果顯示,二次方程的回歸模型差異極顯著(P<0.01),二次方差分析顯示失擬項檢驗不顯著,說明本實驗所建立的二次回歸方程能較好地反映所考察因素與響應值之間的關系,實驗設計科學合理。通過工藝條件的優化,考慮到生產的經濟性和后續產物的分離純化,選擇腸膜明串珠菌CICC 23614最佳培養基成分為:蔗糖101.31 g/L,細菌蛋白胨5.66 g/L,Na2HPO4·12H2O 1.11 g/L和KH2PO40.15 g/L。在優化后的培養基條件下,發酵24 h的蔗糖轉化率為91.9%,與預測值誤差僅為2.13%,為以后的右旋糖酐制備奠定可靠基礎。