海參低聚肽的高通量HPLC-MS/MS分析鑒定和活性篩選

左愛華1,王祖哲1,馬 普1,劉心田2,孫天利1,趙林英1,包衛洋

(1.大連深藍肽科技研發有限公司,遼寧大連 116000; 2.山東省威海市漁業技術推廣站,山東威海 264200; 3.大連海洋大學 水產與生命學院,遼寧大連 116000)

海參作為珍貴的海洋生物,具有滋補效果好、營養及藥用價值高等特點,屬優質的蛋白源[1-2]。蛋白酶解法是目前獲得小分子活性肽的主要方法,海參蛋白經過蛋白酶酶解后獲得海參肽,海參肽在體內更易吸收且具有多種藥理活性,如抗氧化、抗疲勞、降血壓、降血糖、抗炎等[3-5],具有極大的應用潛力,成為小分子活性肽研究中的重點研究對象。

海參肽含有的活性肽段是決定其功效的主要因素,目前關于海參肽的研究多集中在酶解工藝和藥理活性上,對其活性肽段及功效成分的研究較少[6]。僅有的關于海參中活性肽段的研究中多采用傳統分離的方法,即經傳統分離技術分離后獲得單個活性肽再進行分析鑒定后測定活性的思路[7],如福州大學研究人員從海參肽中分離純化獲得的抗氧化肽malsvl[8]和kvlltflvv[9];Zhou等[10]獲得的抗氧化肽GPEPTGPTGAPQWLR;宋淑亮等[11]分離純化獲得的促進NIH/3T3細胞增殖的海參肽SP12;以及其他研究人員獲得的EVSQGRP、CRQNTLGHNTQTSIAQ、VSRHFASYAN等ACE抑制肽[12-13]。但采用此分離純化的方法存在眾多缺點,如效率低下、所需樣品量多、分離純化步驟繁瑣、耗時費力,分離獲得肽段有限以及功效不確定等[14]。因此,急切需要建立一種高效率且能夠快速簡便獲得海參肽中多個活性肽段的方法。

液相色譜-質譜聯用技術把色譜的分離能力和質譜的結構鑒定能力相結合,是蛋白質組學研究中常用手段,目前已逐漸應用于肽組學的分析及活性肽段的發現中[15-16],如用于乳蛋白水解物中活性肽的鑒定[17]、蔬菜蛋白酶解物中抗氧化肽的分析鑒定[18]等。此方法可以一次性分析鑒定多個肽段結構,與分離純化方法相比具有極大的優勢。在獲得肽段結構信息的基礎還需要進行活性篩選。目前小分子活性肽篩選主要方法有利用噬菌體庫進行篩選、基于蛋白降解的篩選、基于MHC-多肽復合物的篩選、基于蛋白質結構及預測的篩選等[19-20]。這些篩選方法普遍存在的問題是耗費時間長,步驟繁瑣,影響因素多,需要專業的或者經驗豐富人員進行操作,普適性差。伴隨大量活性肽的發現以及多肽數據庫的構建,使得基于計算機輔助設計及構效關系的研究成為必然,利用在線構建的數據庫及不同活性肽的構效關系進行活性篩選,在降低研究成本和周期的同時,大大提高活性肽篩選及研發成功的幾率,非常適用于大量活性肽的前期篩選。

本文制備海參低聚肽并對其進行高效率、高通量的HPLC-MS/MS分析鑒定,獲得其中肽段及蛋白質來源,并對其進行相對定量分析,在此基礎上結合在線數據庫及構效關系對獲得肽段進行活性篩選,為海參肽中高活性肽段的發現及闡明其物質基礎奠定基礎,此方法也可用于其他來源的活性肽的分析鑒定及活性篩選,具有極大的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復合蛋白酶制劑(150000 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;色譜級乙腈 默克公司;三氟乙酸 天津博迪化工股份有限公司;色譜級甲酸 美國Thermo fisher公司;刺參(Apostichopusjaponicus)大連鑫玉龍海洋生物種業科技股份有限公司。

Waters Nano ACQUITY高效液相色譜儀 美國waters公司;Q Exactive質譜儀 美國Thermo公司;冷凍離心機 上海醫療器械有限公司;勻漿機 上海標本模型廠;精密PH計 上海精密科學儀器有限公司;超濾裝置 天津泰斯特儀器有限公司;真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參低聚肽的制備 新鮮刺參加入水制成勻漿液置于酶解罐中,刺參與水的質量體積比為1∶2,升溫至50 ℃,加入2.5 mol/L的NaOH溶液調節pH至8.0,加入刺參質量分數0.2%的復合蛋白酶制劑(5000 g新鮮刺參需加入10 g復合蛋白酶制劑),在50 ℃下酶解4 h,酶解結束后升溫至90 ℃滅酶10 min,獲得刺參蛋白酶解液,蛋白酶解液以8000 r/min離心10 min,上清液采用截留分子量為3000 u超濾膜進行分離,過膜液濃縮后冷凍干燥得海參低聚肽。

1.2.2 海參低聚肽的HPLC-MS/MS分析鑒定

1.2.2.1 預處理 采用C18脫鹽柱進行預處理,具體步驟為:C18脫鹽柱預先進行活化平衡,將海參低聚肽溶解于含0.1%三氟乙酸的純水(v/v),樣品上樣,先采用200 μL含0.1%三氟乙酸的純水(v/v)進行清洗,然后采用200 μL 80%乙腈(含0.1%三氟乙酸,v/v)進行洗脫,收集洗脫液,凍干后采用HPLC-MS/MS進行分析鑒定。

1.2.2.2 色譜條件 色譜柱:C18(3 μm,100 ?,75 μm×15 cm);流動相A:0.1%甲酸水(體積比);流動相B:含0.1%甲酸的乙腈(體積比);梯度洗脫條件:0～15 min,5%～10% B,15～90 min,10%～30% B,90～103 min,30%～45% B,流速:600 nL/min;進樣量:2 μg。

1.2.2.3 質譜條件 Q Exactive質譜儀;噴霧電壓2.0 kV;毛細管溫度320 ℃;S-lens RF Level 55;分辨率設置一級70,000@m/z 200,二級17,500@m/z 20;母離子掃描范圍m/z 300～1500;MS1 AGC 3e6,離子注入時間60 ms;MS2 AGC 5e4,離子注入時間50 ms;離子篩選窗口2.2 m/z;碎裂模式HCD;Data-dependent MS/MS Top 20;動態排除時間30 s。

1.2.2.4 質譜數據定性和定量 采用Proteome Discoverer 2.1對采集的質譜數據進行數據檢索,檢索引擎使用Byonic,數據庫使用Uniprot網站(www.uniprot.org)下載的holothuroidea數據庫;數據庫檢索參數如下:無酶切;修飾:甲硫氨酸氧化,天冬酰胺及谷氨酰胺脫酰胺基修飾;母離子質量容忍度±10 ppm;碎片質量容忍度±0.02 u;蛋白Q值小于1%,其他參數為默認。同時對鑒定到的多肽抽提其色譜峰面積,進行相對定量分析。

1.2.3 活性篩選方法 PeptideRanker活性評分(http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php);水溶性評定:采用Innovagen網站(http://www.innovagen.com/proteomics-tools);毒性評定:采用ToxinPred網站(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/);抗高血壓活性評定:采用AHTPin進行降壓活性評分(http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpin/),選擇具體氨基酸個數下的Batch Submission,輸入氨基酸序列,采用默認參數進行分析;采用AntiCP進行抗癌活性評分(http://crdd.osdd.net/raghava/anticp/index.html),采用Virtual Screening,輸入氨基酸序列,默認參數進行分析[22]。

表1 海參低聚肽的HPLC-MS/MS 相對定量結果Table 1 Relative quantitative result of Apostichopus japonicus oligopeptides by HPLC-MS/MS

2 結果與分析

2.1 海參低聚肽HPLC-MS/MS分析鑒定結果

海參低聚肽經預處理后進行分析檢測,基峰色譜圖如圖1所示,從圖1中可以看出整個色譜梯度內色譜峰飽滿,基峰色譜峰眾多,分布均勻,顯示色譜分離效果較高,且樣本組成較為復雜。

圖1 HPLC-MS/MS分析海參低聚肽中肽段的基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatogram of peptides in Apostichopus japonicus oligopeptide by HPLC-MS/MS analysis

進一步經質譜鑒定最終獲得海參低聚肽中多個肽段的氨基酸序列、相對分子質量、序列長度及液相保留時間,共鑒定到88個肽段,大部分肽段的長度在10個氨基酸以內,相對分子質量低于1000 u,且含有大量未經報道的活性多肽。通過多肽的豐度計算峰面積百分比進行相對定量分析,前30個高含量肽段的結果見表1,從表1中可以看出,肽段GFDGPEGPR的含量最高,占峰面積百分比的41.33%,其次為SRPQYPQYPS、GPAGPTGPTGPA、FDGPEGPR,分別占峰面積百分比為21.12%、10.79%、7.58%,它們是海參低聚肽中的主要肽段。

表2 海參低聚肽中肽段的來源蛋白質Table 2 Source proteins of the identified peptides in Apostichopus japonicus oligopeptide

表3 海參低聚肽中篩選獲得的降壓肽Table 3 Antihypertensive peptides screened in Apostichopus japonicus oligopeptides

同下載的海參蛋白數據庫進行比對,結果顯示鑒定到的肽段共來源于19種海參蛋白,豐度占前10位的蛋白質信息見表2,從表2中可以看出肽段來源的主要蛋白質為膠原蛋白、α-Ⅰ型膠原蛋白、富含甘氨酸膠原蛋白、Ⅱ型膠原纖維及細胞外基質蛋白3等,其中膠原蛋白占比為61.61%,α-Ⅰ型膠原蛋白占23.37%,查找兩種蛋白的分子生物學功能,顯示它們均是細胞外基質的結構成分,這也充分證實了海參體壁蛋白是以膠原蛋白為主[23-24]。

2.2 基于在線數據庫的降壓肽活性篩選

利用在線數據庫對鑒定到的88個肽段進行活性評分、水溶性及毒性評定,選擇活性評分≥0.7、水溶性好且無毒性的肽段,經過篩選后共獲得10個肽段,進一步對10個肽段進行抗高血壓和抗癌評分,結果見表3,從表3中可以看出,具有潛在抗高血壓活性的肽段有9個,它們是KFPPPM、EKFPPPM、GPDGLPGPA、WEPPTFDGGRP、WEPPTFDGGRPI、KDNPSPPF、SNPSPPFE和FDGPEGPR,其中肽段KFPPPM的評分最高,但此肽段在海參肽中的含量很低,KFPPPM和EKFPPPM的核心序列為KFPPPM,WEPPTFDGGRP和WEPPTFDGGRPI的核心序列為WEPPTFDGGRP,KDNPSPPF和SNPSPPFE的核心序列為NPSPPF,而FDGPEGPR和海參低聚肽中含量最高的肽段GFDGPEGPR核心序列為FDGPEGPR。對篩選獲得的10肽段進行抗癌活性評分,結果顯示共8個肽段具有潛在的抗癌活性,其中7個肽段均具有潛在的降高血壓及抗癌活性,而FDGPEGPR和KFPPPM顯示出最強的抗癌活性和較好的抗高血壓活性,具有潛在的開發及應用價值。

2.3 基于構效關系的ACE抑制肽活性篩選

目前已有文獻報道海參肽具有降高血壓及ACE抑制作用[25-27]。降高血壓肽中很重要的一類是ACE抑制肽,ACE抑制肽的生物活性受肽段氨基酸組成、序列結構和長度的影響,眾多學者對ACE抑制肽的構效關系進行研究[28-30],綜合ACE抑制肽的構效關系,總結得出ACE抑制肽的篩選條件為:a. 一級氨基酸序列中含有大量疏水性氨基酸,疏水性氨基酸比例≥1/3。b. C末端倒數3個氨基酸殘基中含有W、Y、F和P,或者C末端倒數第二個氨基酸為脂肪族氨基酸(如V、I、A)、堿性氨基酸(K、R、H)和芳香族氨基酸(F、Y、W),或C末端氨基酸為芳香族氨基酸(F、Y、W)、脂肪族及疏水性氨基酸(V、A、P、I、A、L、M)。c. N端存在芳香族氨基酸(F、Y、W)或堿性氨基酸(K、R、H)或者疏水性的氨基酸(G、A、I、V、L)。依據此篩選條件,對鑒定到的88個肽段進行篩選,得到具有潛在ACE抑制活性肽段:GFDGPEGPR、RPQYPQYPS、GPAGPTGPTGPA、GPAGPPGPPGAS、GPPGPPGPA、GIHVPGSP、GEDHIPGSP、KFPPPM、WEPPTFDGGRPI、WEPPTFDGGRP、RDYIPA、KDFNGIP、GHQGPR、GDDGPDGTPGP、HTPGDPVPL、HSGDALPDPPA,分析這些肽段可以看出,海參肽中的高含量肽段GFDGPEGPR(41.33%)和GPAGPTGPTGPA(10.79%)均具有潛在的ACE抑制活性,但是肽段的GPAGPTGPTGPA的水溶性較差,而肽段RPQYPQYPS和SRPQYPQYPS(21.12%)具有相同的核心序列 RPQYPQYPS,肽段KFPPPM、WEPPTFDGGRPI、WEPPTFDGGRP也是2.2中篩選獲得的潛在降高血壓肽。

結合2.2和2.3活性篩選結果,可以看出海參低聚肽中具有潛在降高血壓活性的核心肽段有KFPPPM、WEPPTFDGGRP、NPSPPF、FDGPEGPR和RPQYPQYPS,經數據庫檢索這些肽段都是未經報道過的新肽段,后續可采用分離純化或者化學合成來驗證其降血壓活性。

3 討論與結論

海參原料來源、生產工藝及生產廠家不同,生產獲得海參肽的分子量及所含肽段結構也各不相同,從而直接影響產品的理化性質、功效以及終端產品中的應用。本單位研究人員前期進行了大量海參肽生產工藝的研究,包括優化酶解工藝(包括蛋白酶、料液比、加酶量、酶解溫度、pH、酶解時間)及生產流程等,得到海參低聚肽的最佳生產工藝,最終獲得高水解度、高回收率及低分子量的海參低聚肽產品。分子量分布測試表明,海參低聚肽中相對分子質量小于1000 u的蛋白質水解物所占比例超過95%。進一步藥理活性研究表明此海參低聚肽具有顯著的抗衰老、抗疲勞、降血糖、補腎壯陽、抗炎及免疫調節等功效[31]。為了更好的闡明海參低聚肽的作用機制及所含的活性肽段,本文采用高通量的HPLC-MS/MS進行海參低聚肽的分析鑒定,并進行相對定量分析,共鑒定得到88個小分子肽段及19種來源蛋白質,且含有大量未經報道的小分子活性肽。在此基礎上根據在線數據庫對88個小分析肽段進行活性篩選,共獲得9個潛在的降壓肽,進一步依據ACE抑制肽的構效關系分析發現,核心肽段KFPPPM、WEPPTFDGGRP、NPSPPF、FDGPEGPR和RPQYPQYPS具有潛在的降壓活性,為發現高活性的肽段和闡明海參低聚肽的物質基礎奠定基礎。

本文也建立了一種高效率、高通量分析鑒定海參低聚肽中肽段的方法,該方法采用C18固相萃取柱進行脫鹽凈化,清除了樣品中的鹽分和其他非蛋白質成分干擾,有效克服了高濃度鹽對質譜檢測的影響,使得小分子肽段得到凈化和富集,尤其適用于低含量小分子肽的分析鑒定。本方法能夠一次性分析鑒定多種小分子肽段的氨基酸序列并確定其蛋白質來源的優勢,有效避免了分離純化過程中耗時費力且只能獲得單一肽的缺點。在此基礎上,建立基于在線數據庫和構效關系的高效、快速且簡便的綜合篩選小分子活性降壓肽的方法,可用于大量小分子降壓肽的初期篩選,大大簡化活性肽發現流程,提高工作效率。該方法已應用于牡蠣肽等不同來源的活性肽中降壓肽的發現,具有極大的應用價值,下一步工作可采用化學合成等方式對活性肽段驗證或者進行計算機輔助結構修飾及藥物設計等,有助于推進活性肽在醫藥領域的研究及應用。