叉頭框蛋白O1在內(nèi)毒素血癥急性腎損傷中的作用*

張夢希， 董 偉， 李志蓮， 校振萌, 3， 李銳釗， 陳源漢， 梁馨苓, 3△

[1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510080； 3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510006]

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是威脅人類健康的常見危重癥，其特征是腎臟損傷及腎功能急劇下降。據(jù)統(tǒng)計，在ICU中，AKI的發(fā)生率可高達(dá)38%～51%[1],其中膿毒血癥AKI的發(fā)生率約占全部類型AKI的50%，目前已經(jīng)成為我國社區(qū)獲得性AKI的首位原因，院內(nèi)獲得性急性腎損傷的第2位原因[2]。膿毒血癥AKI預(yù)后不良，目前臨床尚缺乏防治膿毒血癥AKI的有效藥物，因此找尋膿毒血癥AKI發(fā)病機(jī)制中的新靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。內(nèi)毒素及其所觸發(fā)的炎癥因子瀑布效應(yīng)對腎小管上皮細(xì)胞損傷是引起膿毒血癥AKI的重要因素[3]，但具體分子機(jī)制尚不十分明確。叉頭框蛋白O(forkhead box protein O，F(xiàn)OXO)是FOX家族的一個亞群，從蠕蟲到人類均有表達(dá)。該亞群有4個成員，分別是FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6，其中，F(xiàn)OXO1是FOXO家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員之一[4]。FOXO1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可與細(xì)胞核內(nèi)DNA上的反應(yīng)元件結(jié)合，激活靶基因，在DNA損傷/修復(fù)、應(yīng)激、血管生成、糖代謝和腫瘤發(fā)生等多過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1可在足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞等多種腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并在糖尿病腎病、腎臟纖維化及狼瘡性腎炎等多種疾病中發(fā)揮作用[6-8]。但是在內(nèi)毒素血癥AKI中，關(guān)于FOXO1的研究尚缺乏，本研究旨在探討腎小管上皮細(xì)胞FOXO1是否參與了內(nèi)毒素血癥AKI的發(fā)生及其相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料及試劑

24只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：No.44005800008550)。人近端腎小管上皮HK-2細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。DMEM/F12和胎牛血清(Gibco)；抗FOXO1抗體、山羊抗兔 II 抗和DAPI(Cell Signaling Technology)；抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC-1α)抗體和抗Bax抗體(Abcam)；抗GAPDH抗體(Bioworld)；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS; Sigma,Escherichiacoli055:B5)；Ad-FOXO1(漢恒生物)；MTT(MP Biome-dicals)；MitoTracker Red CMXRos和MitoSOX Red(Invitrogen)；血清肌酐(serum creatinine, SCr)試劑盒(Cayman)；血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)試劑盒(索萊寶)。

2 方法

2.1內(nèi)毒素血癥AKI小鼠模型的構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)表法將24只小鼠隨機(jī)分為4組(n=6)：空白對照(control)組、6 h組、12 h組和24 h組。后3組分別在小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)后的6 h、12 h和24 h行眼球取血并處死，control組小鼠腹腔注射生理鹽水。LPS濃度設(shè)置及時點(diǎn)選取參考以往的文獻(xiàn)報道[9]。

2.2HK-2細(xì)胞的培養(yǎng) 配制含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用0.05%胰酶(含EDTA)進(jìn)行傳代，每4～5 d傳代1次。取處于對數(shù)生長期并且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3FOXO1過表達(dá)腺病毒感染實(shí)驗(yàn) 將HK-2細(xì)胞接種于6孔板，待HK-2細(xì)胞融合率達(dá)40%～50%，棄去培養(yǎng)基，6孔板每孔加2 mL無血清培養(yǎng)基及1 μL病毒液，培養(yǎng)24 h后換液，改用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

2.4MTT法檢測HK-2細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞接種于96孔板，分為對照組及LPS(10、20、40和80 mg/L)組。每組設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔(在96孔板中直接加入培養(yǎng)基)，藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L，即0.5% MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μL二甲基亞砜，置搖床上避光振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔在560 nm處的吸光度值(A值)。細(xì)胞相對活力(%)=(處理組A值-空白孔A值)/(對照組A值-空白孔A值)×100%。

2.5MitoTracker染色 將細(xì)胞種植于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿里，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行染色。棄去舊培養(yǎng)基，加少量無血清培養(yǎng)基沖洗3次，每皿加入500 μL MitoTracker Red CMXRos工作液(1∶5 000，200 nmol/L),于37 ℃孵箱中避光孵育25 min，棄去染液，PBS洗3次，最后加入500 μL無血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，準(zhǔn)備用激光共聚焦顯微鏡拍照。正常細(xì)胞內(nèi)線粒體呈絲線狀，而損傷時的線粒體可出現(xiàn)腫脹及片段化改變[10]。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 每個樣本取50 μg總蛋白，使用8% SDS-PAGE，上樣后100 V電泳90 min，PVDF膜200 mA轉(zhuǎn)膜120 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入 I 抗[分別為 FOXO1(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)]4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，每次5 min, II 抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。洗膜后ECL法顯色。使用ImageJ軟件對Western條帶灰度進(jìn)行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參照。

2.7RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)TRIzol說明書操作一步法提取總RNA，采用核酸定量儀 NanoDrop Lite測定樣本RNA濃度，且A260/A280比值應(yīng)為1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。樣品-80 ℃保存?zhèn)溆谩８饕镄蛄幸姳?。

表1 RT-qPCR引物序列

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，1個循環(huán)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火25 s、72 ℃延伸25 s，此3步共循環(huán)40次；72 ℃終止5 min。每個樣本設(shè)2個復(fù)孔，定量結(jié)果取平均值。

2.8MitoSOXTM染色 用13 μL二甲基亞砜溶解50 μg MitoSOXTM試劑，配制5 mmol/L儲存液。使用時用無血清培養(yǎng)基稀釋成5 μmol/L工作液，6孔板每孔加1.0～2.0 mL，于37 ℃孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min,準(zhǔn)備用激光共聚焦顯微鏡拍攝。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 內(nèi)毒素血癥AKI時小鼠腎臟FOXO1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)

小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)后6 h、12 h和24 h行眼球取血并處死，獲取小鼠血清及腎組織標(biāo)本，結(jié)果顯示，小鼠SCr和BUN隨時間延長呈上調(diào)趨勢，且在24 h上升最為顯著(P<0.05)，見圖1A;小鼠腎組織病理染色結(jié)果顯示，LPS腹腔內(nèi)注射24 h后，皮質(zhì)及外髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕微的腫脹及空泡樣變性、管腔狹窄，見圖1B;腎組織電鏡可見，LPS 24 h組小鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、嵴消失，空泡樣變性，見圖1C。上述結(jié)果提示LPS可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥急性腎損傷。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS各組FOXO1蛋白表達(dá)量下調(diào)，且在24 h組下調(diào)最為顯著(P<0.05)，見圖1D。FOXO1在腎組織中廣泛表達(dá)，小鼠腎組織免疫熒光可見FOXO1在腎小管(尤其是近端腎小管)上皮細(xì)胞中表達(dá)量較高，在腎小球中表達(dá)量相對較低。與對照組相比，LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥AKI小鼠腎組織中FOXO1下調(diào)(紅色熒光示FOXO1，藍(lán)色示細(xì)胞核)，見圖1E。提取小鼠腎皮質(zhì)RNA，RT-qPCR結(jié)果顯示FOXO1轉(zhuǎn)錄水平下降(P<0.05),見圖2。上述結(jié)果提示，腎小管上皮細(xì)胞FOXO1可能參與了內(nèi)毒素血癥AKI的發(fā)生發(fā)展。與此同時，線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因(PGC-1α、線粒體復(fù)合體I亞基Ndufs1和線粒體復(fù)合體V亞基Atp5o)的轉(zhuǎn)錄均下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The expression of FOXO1 in kidney of mice was down-regulated during LPS-induced AKI. A: blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) were increased after LPS injection; B: periodic acid-Schiff (PAS) stainning (×400) indicated vacuolar deformation and swelling of renal tubular epithelial cells; C: electron microscopy (×39 000) showed that mitochondrial injury in tubular epithelial cells, as exhibited by the disorder or disappearance of crista, and mitochondrial swelling and deformation, was aggravated in the LPS group; D and E: Western blot and immunofluorescence (×400) revealed that FOXO1 protein in mouse kidney tissue was down-regulated over time. MFI: mean fluorescence intensity. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 內(nèi)毒素血癥AKI時，小鼠腎臟FOXO1表達(dá)下調(diào)

Figure 2. The mRNA expression of FOXO1, PGC-1α, Ndufs1 and Atp5o was down-regulated during LPS-induced AKI. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2 內(nèi)毒素血癥AKI時，小鼠腎臟FOXO1及線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因mRNA表達(dá)下調(diào)

2 LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞FOXO1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)

為檢測內(nèi)毒素血癥AKI對腎小管上皮細(xì)胞FOXO1表達(dá)的影響，本研究用LPS(濃度為40 mg/L)干預(yù)HK-2細(xì)胞48 h。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)FOXO1蛋白的表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，見圖3A。RT-qPCR結(jié)果提示，F(xiàn)OXO1的mRNA也出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05),見圖3B。同樣地，免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS處理組的HK-2細(xì)胞內(nèi)FOXO1熒光強(qiáng)度較弱(P<0.05),見圖3C。這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前述動物實(shí)驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象一致，因而進(jìn)一步證明了內(nèi)毒素血癥可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞FOXO1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降。

3 過表達(dá)FOXO1減輕LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體損傷

LPS可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)FOXO1下調(diào)，同時引起線粒體生物合成關(guān)鍵調(diào)控分子PGC-1α下調(diào)以及促凋亡因子Bax上調(diào);利用過表達(dá)腺病毒載體對人FOXO1基因進(jìn)行構(gòu)建及包裝，并用該病毒感染HK-2細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO1過表達(dá)上調(diào)了PGC-1α，并下調(diào)了Bax蛋白水平(P<0.05)，見圖4A。采用不同濃度(10、20、40和80 mg/L)的LPS刺激HK-2細(xì)胞時，細(xì)胞活力呈不同程度下降，而FOXO1過表達(dá)腺病毒組在不同LPS濃度條件下的細(xì)胞活力均高于空病毒載體組(P<0.05)，見圖4B。這提示FOXO1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞活力下降。利用活細(xì)胞線粒體染料Mitotracker標(biāo)記HK-2細(xì)胞線粒體，發(fā)現(xiàn)LPS刺激可引起腎小管上皮細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)片段化改變，而過表達(dá)FOXO1可減輕LPS引起的這種線粒體片段化(紅色示線粒體)，見圖4C。MitoSOXTM染色可標(biāo)記線粒體超氧化物，反映線粒體氧化呼吸功能損傷程度。LPS刺激下，HK-2細(xì)胞線粒體產(chǎn)生大量超氧化物，MitoSOXTM染色呈強(qiáng)陽性；FOXO1過表達(dá)后，超氧化物產(chǎn)生量較LPS刺激時減少，見圖4D。此外，RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，LPS刺激HK-2細(xì)胞可引起線粒體復(fù)合體I亞基Ndufb8和線粒體復(fù)合體V亞基Atp5g1這兩個線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因的mRNA水平下調(diào)，而過表達(dá)FOXO1可減輕該下調(diào)程度(P<0.05)，見圖4E。由此可見FOXO1過表達(dá)可減輕LPS引起的HK-2細(xì)胞線粒體損傷及氧化磷酸化功能障礙。

Figure 3. FOXO1 protein and mRNA expression was down-regulated in the HK-2 cells induced by LPS. Western blot (A), RT-qPCR (B) and immunofluorescence (C; ×400) for deteting the expression of FOXO1 in HK-2 cells that have undergone different interventions. MFI: mean fluorescence intensity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)FOXO1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)下調(diào)

討 論

LPS是革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素，是膿毒血癥炎癥反應(yīng)的主要致病因子之一。LPS不僅可觸發(fā)大量炎癥因子瀑布效應(yīng)，而且可通過活化Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷[11],因此采用LPS構(gòu)建內(nèi)毒素血癥模型可以有效且相對合理地模擬膿毒血癥時內(nèi)毒素對機(jī)體的損傷作用。然而，內(nèi)毒素血癥引起AKI的具體分子機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO家族在腎臟中廣泛表達(dá)，參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。在糖尿病腎病中存在FOXO1表達(dá)及活化障礙并參與疾病發(fā)生及進(jìn)展，足細(xì)胞過表達(dá)FOXO1可通過活化PTEN誘導(dǎo)激酶(PTEN-induced kinase，PINK)/parkin通路減輕高糖誘導(dǎo)的線粒體自噬和足細(xì)胞凋亡[6]；此外，過表達(dá)FOXO1還可減輕高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞PGC-1α下調(diào)及線粒體損傷[12]。同時，腎小管上皮細(xì)胞過表達(dá)FOXO1還可抑制小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)相關(guān)分子如信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)的表達(dá)，從而減輕TIF及小管細(xì)胞凋亡[8]。但尚無FOXO1在內(nèi)毒素血癥AKI中的研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素血癥AKI時腎小管上皮細(xì)胞FOXO1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)；并且在細(xì)胞模型中，過表達(dá)FOXO1可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞活力下降，減輕線粒體損傷和氧化磷酸化功能障礙，因此我們推測腎小管上皮細(xì)胞FOXO1表達(dá)下調(diào)可能是內(nèi)毒素血癥AKI的發(fā)病機(jī)制之一。

腎臟是人體第二大能量需求器官，其線粒體含量僅次于心臟。在腎小管上皮細(xì)胞中線粒體含量十分豐富。線粒體通過其內(nèi)膜電子傳遞鏈將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵入膜間隙，在內(nèi)膜上產(chǎn)生電化學(xué)梯度，從而驅(qū)動二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)磷酸化為三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，用來維持腎小管上皮細(xì)胞的電化學(xué)梯度及協(xié)助溶質(zhì)運(yùn)輸，以實(shí)現(xiàn)腎臟重吸收等重要生理功能[13]。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧生成的，當(dāng)線粒體損傷時，電子傳遞鏈功能出現(xiàn)異常，可引起線粒體大量超氧化物產(chǎn)生，對細(xì)胞造成氧化損傷[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷是內(nèi)毒素血癥AKI的重要病理生理改變，由此引起的能量代謝異常以及線粒體超氧化物、細(xì)胞色素酶C、凋亡激活因子等釋放所致的腎小管上皮細(xì)胞程序性死亡是重癥AKI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素血癥可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞活力下降及線粒體損傷，過表達(dá)FOXO1可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力下降，減輕線粒體損傷，說明FOXO1確實(shí)參與了內(nèi)毒素血癥AKI腎小管上皮細(xì)胞損傷的發(fā)生。那么，F(xiàn)OXO1是通過什么機(jī)制參與內(nèi)毒素血癥AKI的呢？FOXO1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其下游多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase，SOD2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和PGC-1α等均可以影響線粒體能量代謝及再生。其中，PGC-1α是維持線粒體形態(tài)及生物合成的“關(guān)鍵調(diào)控因子”[16]。文獻(xiàn)證實(shí)，在急性腎損傷中PGC-1α轉(zhuǎn)錄及表達(dá)下調(diào)，繼而引起線粒體功能紊亂及損傷從而介導(dǎo)多種類型AKI的發(fā)生[17-18]。在肝細(xì)胞等已證實(shí)，F(xiàn)OXO1是PGC-1α的上游轉(zhuǎn)錄因子[19]，并且在糖尿病腎病模型中，也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FOXO1可以上調(diào)PGC-1α[8]，但在腎小管上皮細(xì)胞中尚不明確FOXO1是否可調(diào)控PGC-1α。在我們的研究中，F(xiàn)OXO1過表達(dá)可減輕內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞活性氧增加，同時可增加PGC-1α轉(zhuǎn)錄以及PGC-1α下游控制氧化磷酸化的分子——Ndufb8和Atp5g1的轉(zhuǎn)錄。因此我們推測，在內(nèi)毒素血癥AKI時腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)FOXO1下調(diào)可能引起PGC-1α等線粒體功能維持關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞線粒體損傷及功能障礙，從而介導(dǎo)內(nèi)毒素血癥AKI的發(fā)生。具體機(jī)制我們需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

Figure 4. Over-expression of FOXO1 attenuated HK-2 cell injury induced by LPS. A: over-expression of FOXO1 reversed LPS-induced PGC-1α down-regulation and Bax up-regulation in HK-2 cells; B: MTT assay showed that Ad-FOXO1 attenuated LPS-induced cell viability depression; C: MitoTracker staining showed the morphological changes of mitochondria in HK-2 cells (×400); D: MitoSOX staining showed mitochondrial superoxide production in HK-2 cells (×400); E: the mRNA levels of mitochondrial complex I (Ndufb8) and mitochondrial complex V (Atp5g1) were quantified in the mitochondrial fractions. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vsvector group.

圖4 過表達(dá)FOXO1可減輕LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞FOXO1水平下調(diào)介導(dǎo)內(nèi)毒素血癥AKI腎小管上皮細(xì)胞損傷這一新的機(jī)制。該研究結(jié)果提供了內(nèi)毒素血癥AKI的新的干預(yù)靶點(diǎn)，為內(nèi)毒素血癥AKI的防治提供了新策略。