黃芩苷通過調控TGF-β1/TAK-NF-κB通路對胰腺纖維化的防治作用*

范建偉， 許小凡， 辛嘉萁， 段麗芳， 熊慧敏， 姜盛楠， 楊 娟， 彭青俠， 魏圓圓， 張 紅△

(陜西中醫藥大學 1基礎醫學院， 2醫學科研實驗中心， 陜西 咸陽 712046)

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)病因復雜，起始過程各異，持續進展的慢性炎癥最終導致胰腺組織結構和功能發生改變，并逐漸被纖維組織所取代，引起不同程度的胰腺內、外分泌功能障礙[1]。胰腺纖維化已被視為各種原因所致CP的共同病理學特征，是慢性胰腺炎病理過程中的核心事件和關鍵靶標[2-3]。

CP多采用對癥治療，而對于胰腺纖維化缺乏針對性治療[4]。近年有研究發現中醫經方大柴胡湯可以減輕CP患者的臨床癥狀[5]。我們課題組前期研究發現，大柴胡湯可以減輕CP小鼠胰腺纖維化[6]。黃芩苷(baicalin，C21H18O11)是大柴胡湯組方中臣藥黃芩的重要成分，有學者研究發現黃芩苷可下調胰腺組織轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達水平，減少膠原纖維的沉積，對CP大鼠胰腺纖維化具有治療作用[7]。但是，黃芩苷在抑制TGF-β1后又是如何調控其下游機制進而發揮防治CP胰腺纖維化的作用，目前尚不清楚。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)作為重要的轉錄因子，近年來研究發現其活化程度與胰腺纖維化進展密切相關[8-9]。有學者在大鼠急性肝損傷的研究中發現，黃芩苷可通過抑制NF-κB信號通路活化，進而抑制卵圓細胞的增殖，并誘導已增殖的卵圓細胞向成熟的肝細胞及膽管細胞分化，發揮對肝臟的保護作用[10]。那么，黃芩苷對CP胰腺纖維化進展中NF-κB信號通路是否具有調控作用，其具體調控機制是否與TGF-β1有關，目前尚不明確。本研究通過腹腔注射20% L-精氨酸誘導小鼠CP模型，觀察黃芩苷對CP小鼠胰腺組織TGF-β1、磷酸化轉化生長因子β活化激酶1(phosphorylated TGF-β-activated kinase 1，p-TAK1)及NF-κB的影響，探討黃芩苷防治CP胰腺損傷及胰腺纖維化的作用機制，為其臨床應用提供可靠依據，并為CP的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 藥品及試劑

黃芩苷(21967-41-9)購于笛柏生物科技試劑公司；L-精氨酸(A6969-100G)購于Sigma-Aldrich；抗NF-κB p65抗體(SC-8008)和抗轉化生長因子βⅠ型受體(transforming growth factor-β receptor type Ⅰ，TGF-βRⅠ)抗體(SC-402)購于Santa Cruz；抗纖維連接蛋白(fibronectin，FN)抗體(bsm-33143M)和抗p-TAK1抗體(bs-5435R)購于博奧森試劑公司；TGF-β1 ELISA檢測試劑盒(EK0515)、抗GAPDH抗體(BM1623)、HRP標記的羊抗小鼠(BA1050)及羊抗兔II抗(BA1054)購于博士德試劑公司；RNA提取試劑盒(9767)、反轉錄試劑(RR036A)及實時熒光定量PCR試劑(RR820A)購于TaKaRa；特超敏ECL化學發光試劑購于碧云天試劑公司；Masson染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所；其它試劑由當地生物制劑公司提供的分析純化學試劑。

2 實驗方法

2.1實驗動物分組及造模 健康雄性昆明小鼠58只，6～8周齡，體重20～25 g，購于空軍軍醫大學動物實驗中心(合格證號0014945)，在(22±2)℃的環境中自由取食飲水，實驗前適應性飼養1周。隨機分為3組：空白對照(control)組、CP模型(CP)組和黃芩苷治療(baicalin)組(對照組n=18，每時點6只；CP模型組n=24，每時點8只；黃芩苷治療組n=16，每時點8只)。CP模型組及黃芩苷治療組小鼠均給予腹腔注射20% L-精氨酸(每次3 g/kg，每周1次，每次2輪，間隔1 h，持續6周)；空白對照組給予腹腔注射與L-精氨酸等體積的生理鹽水。治療組于造模2周后開始腹腔注射黃芩苷(每次100 mg/kg，每次1次，每周6天，持續4周)；空白對照組及CP模型組分別給予腹腔注射與黃芩苷等體積的生理鹽水。

2.2標本的采集與處理 分別在造模后各時間點麻醉處死動物，下腔靜脈取血并分離血清，凍存于-20 ℃用于后續ELISA檢測。完整摘除胰腺，均勻分配胰腺頭、體、尾部，將部分胰腺組織置于10%中性甲醛溶液浸泡固定；另一部分胰腺組織迅速放入液氮中速凍，再轉入-80 ℃冰箱保存，用于后續提取蛋白及RNA。

2.3胰腺組織病理學的觀察 甲醛固定后的胰腺組織進行脫水、石蠟包埋、3 μm切片，HE及Masson染色觀察胰腺組織形態學改變及纖維化程度。

2.4ELISA檢測血清TGF-β1濃度的變化 使用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清TGF-β1濃度，按照試劑盒提供的標準方法，檢測并記錄血清樣本所測濃度。

2.5免疫組織化學染色觀察胰腺組織FN和NF-κB的表達 胰腺組織3 μm切片常規脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液抗原修復15 min，PBS洗3次，每次5 min,3%過氧化氫室溫孵育10 min，5% BSA室溫孵育1 h，滴加I抗[抗FN抗體(1∶200)或抗NF-κB p65抗體(1∶150)]于4 ℃過夜，滴加即用型生物素化羊抗小鼠IgG II抗，室溫孵育1 h，滴加SABC室溫孵育40 min，DAB顯色劑顯示3 min，蘇木素復染、脫水透明及封片。

2.6Western blot檢測胰腺組織FN、TGF-βRⅠ、p-TAK1及NF-κB的蛋白水平 取凍存胰腺組織，加入適量蛋白裂解液，充分機械勻漿，冰上孵育30 min，4 ℃離心10 min，提取離心上清液，BCA法蛋白定量，加入loading buffer將樣品稀釋至4 g/L，上樣至SDS-PAGE，電轉移至PVDF膜，封閉1 h，滴加I抗分別為GAPDH(1∶1 000)、FN(1∶400)、TGF-βRⅠ(1∶400)、p-TAK1(1∶400)及NF-κB(1∶400)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5 min。HRP標記的II抗(羊抗兔或羊抗小鼠IgG 1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,每次5 min。滴加ECL，在Protein Simple化學發光成像系統中，選取適當時間曝光并拍照。

2.7real-time PCR檢測胰腺組織基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)及金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloprotease-1，TIMP-1)的mRNA表達 MMP-1/TIMP-1引物序列見表1，按試劑盒操作步驟提取胰腺組織總RNA，逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR，反應體系為:SYBR 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ROX reference dye Ⅱ 0.08 μL,cDNA(20 μg/L)7 μL,ddH2O 1.32 μL。擴增條件為:50 ℃循環預熱2 min;95 ℃循環預變性10 min;95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參照，采用2-ΔΔCt法定量比較Ct值，計算目的基因的相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統計學處理

所有實驗數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，計量數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 黃芩苷可以減輕胰腺組織損傷及胰腺纖維化

與空白對照組相比，在造模后2周，CP模型組小鼠胰腺組織出現水腫，炎癥細胞浸潤，腺泡萎縮及少量壞死，并可見少量膠原纖維的沉積；4周時胰腺損傷持續加重，炎癥細胞浸潤增多，并出現管狀化結構，膠原纖維沉積加重；6周時胰腺小葉結構破壞嚴重，腺泡進一步萎縮，被大量的管狀化結構所取代，甚至出現類似空泡樣結構，胰腺纖維化明顯，可見大量膠原纖維沉積。黃芩苷治療組小鼠胰腺損傷程度明顯輕于同時點的CP模型組，僅見部分腺泡萎縮及少量炎癥細胞浸潤，膠原纖維的沉積明顯減輕，見圖1、2。

胰腺組織纖維化指標FN免疫組化結果顯示，空白對照組胰腺組織結構良好，胰腺小葉間無膠原纖維的沉積，CP模型組在造模4和6周時胰腺組織間隙可見明顯陽染的膠原纖維，并隨造模時間的延長，FN的陽染表達呈上升趨勢；而黃芩苷治療組在4和6周時FN的陽染表達明顯低于同時間點的CP模型組，見圖3。通過Western blot檢測胰腺組織FN的表達顯示類似的結果，CP模型組在4和6周時FN的蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；而黃芩苷治療組胰腺組織FN的蛋白表達水平顯著低于CP模型組(P<0.01)，見圖4。

Figure 1. The pancreatic morphological changes of mice induced by 20% L-arginine (HE staining, ×200). w: weeks.

圖1 胰腺組織的病理學改變

Figure 2. The degree of fibrosis in pancreatic tissues (Masson staining, ×200). w: weeks.

圖2 胰腺組織的纖維化程度的改變

2 黃芩苷可抑制TGF-β1、TGF-βRⅠ及p-TAK1的表達

通過ELISA檢測血清TGF-β1濃度的變化。在造模后2和4周時血清TGF-β1的表達水平明顯升高(P<0.01)；而黃芩苷治療組血清TGF-β1的表達水平明顯低于CP模型組(P<0.01),見圖5。

通過Western blot檢測發現在造模后4周時胰腺組織TGF-βRⅠ及p-TAK1的蛋白水平顯著升高(P<0.01)，6周時較前有所下降，但仍較空白對照組高；而黃芩苷治療組胰腺組織的TGF-βRⅠ及p-TAK1的蛋白水平明顯低于CP模型組(P<0.01)，見圖6。

3 黃芩苷可以抑制胰腺組織NF-κB的表達

造模后4和6周，在胰腺腺泡細胞、浸潤的炎癥細胞和胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSC)可見大量NF-κB陽性表達,并且NF-κB的蛋白表達量明顯高于空白對照組；而黃芩苷治療組NF-κB的表達水平則顯著低于相同時點的模型組(P<0.01)，見圖7、8。

4 黃芩苷對MMP-1/TIMP-1平衡的調控作用

與空白組相比，CP模型組小鼠在造模2周時胰腺組織MMP-1 mRNA表達水平開始下降，在4周時降低更為顯著(P<0.01)，6周時仍處于較低水平(P<0.01)；而黃芩苷治療組在造模4和6周時胰腺組織MMP-1的mRNA表達水平較CP模型組明顯升高(P<0.01),見圖9。

Figure 3. The expression of FN in the pancreas of mice (IHC, ×400). w: weeks.

圖3 免疫組化染色觀察胰腺組織FN表達的變化

Figure 4. The protein level of FN in the pancreas of mice determined by Western blot. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖4 Western blot檢測胰腺組織FN蛋白表達的變化

與空白組相比，CP模型組小鼠胰腺組織TIMP-1的mRNA表達水平在造模2和4周時顯著升高(P<0.01)，并持續高表達，在6周時TIMP-1 的mRNA表達水平雖有所下降，但仍明顯高于空白對照組(P<0.01)；與CP模型組比較，黃芩苷治療組胰腺組織TIMP-1的mRNA表達水平則相對較低，見圖10。

Figure 5. The serum level of TGF-β1 in mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖5 血清TGF-β1含量的變化

討 論

慢性胰腺炎是臨床上常見的消化系統疾病，主要表現為胰腺實質的慢性炎癥，胰腺漸進性慢性炎癥反應最終導致胰腺纖維化，引起胰腺內、外分泌功能缺陷，嚴重影響患者的生活質量[11]。因此，深入探討胰腺纖維化進展中的相關分子機制，有效遏制CP病程進展，是臨床上迫切需要解決的難題。

近年來多項臨床研究顯示，以大柴胡湯為基本組方的中藥治療CP臨床療效確切[4-5]。課題組前期的研究發現[6, 12-13]，大柴胡湯對小鼠CP模型胰腺纖維化具有抑制作用，而黃芩作為復方大柴胡湯的臣藥，具有清熱解毒之功效。黃芩苷是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗纖維化及清除氧自由基等作用[14-15]。

Figure 6. The protein levels of TGF-βRⅠ and p-TAK1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖6 胰腺組織TGF-βRⅠ及p-TAK1蛋白水平的變化

本實驗采用腹腔注射20% L-精氨酸成功誘發小鼠CP模型，模擬出CP病程進展中胰腺組織的病理變化。予以腹腔注射黃芩苷干預后發現，黃芩苷治療組小鼠的胰腺損傷程度明顯輕于CP模型組，僅見部分腺泡萎縮及少量炎癥細胞浸潤，膠原纖維的沉積明顯減輕，胰腺組織FN的表達也顯著降低，提示黃芩苷可明顯減輕CP小鼠胰腺組織損傷程度，減少膠原纖維的沉積，從而發揮抗胰腺纖維化的作用。

研究發現，TGF-β是重要的促纖維化細胞因子，在CP病程進展中，胰腺組織中TGF-β表達上調，可刺激胰腺微環境中胰腺星狀細胞活化，促使細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成，從而導致胰腺纖維化[16]。我們研究發現，在復制CP模型后小鼠血清的TGF-β1表達水平顯著升高，而黃芩苷可降低TGF-β1的表達水平。但是，黃芩苷在降低TGF-β1的產生后是如何調控其下游機制，進而發揮抗胰腺纖維化的作用，目前尚不清楚。

有學者在心肌纖維化的研究中發現，TGF-β1可激活其下游底物TAK1，進而啟動相關基因的轉錄，導致膠原纖維的沉積[17]。亦有研究發現[18-19]，TAK1的過度表達可促進NF-κB信號通路的活化，而NF-κB的活化程度與胰腺纖維化進展密切相關[8-9]。

NF-κB以同源或異源二聚體形式存在，由NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA/p65、Re1B及c-Rel 5種Rel家族成員組成[20]。有研究發現，RelA/p65是NF-κB最常見的異源二聚體，也是NF-κB信號通路的關鍵蛋白[21]。在靜息狀態下，胞質中的NF-κB與其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)相結合形成三聚體，使其呈非活化狀態。當機體在各種損傷因素作用下，IκB激酶(IκB kinase，IKK)誘導IκB發生磷酸化，磷酸化的IκB在泛素介導下被蛋白酶降解，使NF-κB二聚體得以進入細胞核內，從而啟動和調控相關基因的轉錄[22]。

Figure 7. The expression of NF-κB in the pancreas of mice (IHC, ×400). w: weeks.

圖7 免疫組化染色觀察胰腺組織NF-κB表達的變化

Figure 8. The protein level of NF-κB in the pancreas of mice determined by Western blot. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖8 Western blot檢測胰腺組織NF-κB蛋白的表達變化

Figure 9. The mRNA expression of MMP-1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖9 胰腺組織MMP-1的mRNA表達變化

Figure 10. The mRNA expression of TIMP-1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖10 胰腺組織TIMP-1的mRNA表達變化

我們在實驗中還發現，胰腺組織TGF-βRⅠ及p-TAK1表達水平升高的同時，胰腺組織NF-κB p65的表達水平亦明顯升高。因此本研究提示，在胰腺纖維化病程進展中，TGF-β1可能通過與TGF-βRⅠ相結合，促進TAK1的磷酸化，進而激活NF-κB信號通路。而經黃芩苷治療后，血清TGF-β1表達水平降低的同時，胰腺組織TGF-βRⅠ、p-TAK1及NF-κB的蛋白水平均顯著下降，表明黃芩苷可能通過調控TGF-β1/TAK-NF-κB信號通路活性，發揮抗胰腺纖維化的作用。

大量研究證實，胰腺纖維化的發生與ECM的合成增多、降解減少有關[23-24]，而ECM降解受到基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制物的調控[25]。我們在研究中發現，造模后CP模型組胰腺組織MMP-1的mRNA表達水平下降，并維持較低水平，而TIMP-1的mRNA表達水平則顯著升高，兩者的表達呈現失衡狀態，提示在CP病程進展中伴隨著MMP-1的表達下調及TIMP-1的過度表達，影響ECM的降解而導致其過度沉積，最終表現為胰腺纖維化的加重。黃芩苷治療組胰腺組織各時間點MMP-1的mRNA表達水平較CP模型組升高，而TIMP-1的mRNA表達水平較CP模型組有所下降，MMP-1/TIMP-1的失衡狀態有所糾正，ECM沉積明顯減少。關于MMP-1/TIMP-1失衡的調控機制，目前認識還不夠清楚。我們課題組在PSC離體實驗中，發現TGF-β1可以明顯誘導PSC活化，而采用siRNA干擾NF-κBp65基因后，PSC活化程度及其分泌炎性細胞因子的能力明顯降低，同時發現MMP-1/TIMP-1的失衡狀態得以改善，提示NF-κB信號通路活化與MMP-1/TIMP-1的失衡有關，抑制NF-κB信號通路可能通過調控MMP-1/TIMP-1平衡，遏制PSC活化，從而發揮抗胰腺纖維化的作用[26]。

綜上所述，CP進展中過度生成的TGF-β1可能通過與TGF-βRⅠ結合，引發TAK-NF-κB信號通路活化，進而導致胰腺纖維化。黃芩苷可以抑制TGF-β1生成，使TGF-β1/TAK-NF-κB信號通路的活化程度減低，進而調控MMP-1/TIMP-1的平衡，減少ECM沉積，抑制胰腺纖維化的進展，通過多靶點干預胰腺纖維化，有效遏制了CP病程進展。