內質網應激在氧化三甲胺促人臍靜脈內皮細胞氧化應激中的作用*

溫仁輝， 柯世業， 石光耀， 劉定輝， 2， 余顯冠， 凌葉盛， 朱潔明， 錢孝賢， 2△

(中山大學 1附屬第三醫院心內科， 2中西醫結合研究所， 廣東 廣州 510630)

心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的發病率與死亡率在全球范圍內始終居高不下。越來越多的研究表明，除了傳統的心血管疾病危險因素外，定殖于腸道中數量龐大的微生物菌群及其代謝產物也通過各種復雜的方式在心血管疾病的發生發展中起重要作用[1]。研究顯示，氧化三甲胺(trimethylamineN-oxide，TMAO)作為一種重要的腸道菌群代謝產物，與心血管疾病風險之間存在顯著的相關性[2-5]。有研究表明,不同膳食處理的各組小鼠血漿TMAO水平與動脈粥樣硬化斑塊大小存在顯著正相關[2],提示TMAO可能是一種新型的促動脈粥樣硬化的危險因子。然而對于TMAO促動脈粥樣硬化的明確機制目前尚未有定論。

血管內皮功能障礙作為動脈粥樣硬化的始動環節，在動脈粥樣硬化發展的各個階段均起到了關鍵的作用。活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的過度產生，以及細胞內氧化應激的增加是血管內皮功能障礙的重要的表現[6]。內質網作為真核細胞中蛋白質合成、折疊與分泌的重要細胞器，具有極強的內穩態體系[7]。當各種理化或生物因素引起內質網結構或功能損傷時，錯誤折疊蛋白將在內質網累積，稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。當細胞發生內質網應激時，內質網上3種跨膜蛋白PERK(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase)、ATF6(activating transcription factor 6)和IRE-1(inositol-requiring enzyme 1)與分子伴侶GRP78/BiP(glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein)解離，活化并啟動未折疊蛋白質反應(unfolded protein response，UPR)，保護由ERS所引起的細胞損傷，恢復細胞功能[8-9]。然而，嚴重或長期持續的內質網應激則將導致細胞進一步的損傷，包括細胞氧化應激的增加和細胞凋亡等[10]。有研究表明，內質網應激導致的氧化應激增加在動脈粥樣硬化的發生發展過程中發揮著重要作用[11]。

為此，本項工作探討TMAO是否誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)氧化應激的增加，以及內質網應激相關通路在其中發揮的作用，以期為闡明TMAO促動脈粥樣硬化的明確機制提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

Ⅰ型膠原酶和M199培養液購自Gibco；內皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement，ECGS)和氧化三甲胺購自Sigma-Aldrich；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自上海吉泰依科賽公司；CCK-8 試劑盒購自Dojindo；細胞裂解液購自上海碧云天；蛋白定量試劑盒(BCA法)和含EDTA的0.5 g/L胰蛋白酶購自南京凱基；ROS測定試劑盒(化學熒光法)購自南京建成；STF-083010購自MedChemExpress；抗phospho-IRE-1α抗體購自Abcam；抗IRE-1α、GRP78/BiP和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；Ⅱ抗購自武漢博士德。

2 方法

2.1人臍靜脈內皮細胞提取和培養 原代HUVECs提取及培養參照既往文獻報道[12-13]，簡述如下：健康無菌的新生兒臍帶取自中山大學附屬第三醫院產科足月妊娠健康剖宮產產婦，并立即用于原代HUVECs提取，本研究經中山大學附屬第三醫院醫學倫理委員會批準，產婦已簽署知情同意書。將提取的原代HUVECs接種于預鋪明膠的培養瓶，培養在含20%FBS的M199培養液中，并置于5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養。1～3代細胞用于后續實驗。實驗前換用含5%FBS的M199培養液培養2 h，隨即進行后續實驗。

2.2CCK-8法測定細胞活力 將HUVECs按每孔3×103細胞接種于96孔板中并培養24 h后，按照實驗要求給予不同處理。處理結束后，于每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h，使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度(A)值。細胞相對活力(%)=處理組A/對照組A×100%。

2.3細胞內ROS含量的檢測 DCFH-DA是目前常用的細胞內ROS檢測探針，DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，被胞內ROS氧化為強綠色熒光物質DCF，通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內ROS水平。用含EDTA的0.5 g/L胰蛋白酶消化各實驗組的HUVECs，190×g(r=17 cm) 離心5 min收集細胞沉淀，PBS輕輕清洗3次后加入DCFH-DA染色液(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃避光染色30 min，染色結束后以190×g(r=17 cm) 離心5 min，收集細胞沉渣，PBS輕輕清洗3次，再用500 μL PBS重懸細胞，通過流式細胞術分析染色的細胞。利用FlowJo軟件分析實驗結果。接種于激光共聚焦培養皿的HUVECs經不同處理后棄去培養基，用PBS輕輕清洗3次，加入DCFH-DA染色液(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃避光染色30 min，染色結束后PBS輕輕清洗3次，立即用倒置相差熒光顯微鏡觀察并拍攝。

2.4Western blot 將HUVECs接種于6孔板中，貼壁生長至80%時給予不同處理，待處理結束后棄去培養基，用預冷的PBS輕輕洗2次，每孔加入60 μL細胞裂解液，冰上充分裂解后用蛋白刮刮取細胞蛋白，收集裂解液并于4 ℃超速離心機14 000×g(r=8 cm) 離心15 min后取上清，BCA法測定蛋白含量。總蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入phospho-IRE-1α、IRE-1α、GRP78/BiP及GAPDH(均為1∶1 000)Ⅰ抗4 ℃搖床孵育過夜。棄去Ⅰ抗，TBST洗3次，每次10 min,加入Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，棄去Ⅱ抗，TBST洗3次，每次10 min，用化學發光法曝光顯影。最后使用ImageJ軟件分析圖像。

3 統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 25.0 統計學軟件進行統計分析，組間差異性比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度TMAO對HUVECs活力的影響

將HUVECs按每孔3×103細胞接種于96孔板中并培養24 h后，分別予10、30、100和300 μmol/L TMAO作用48 h，或予100 μmol/L TMAO分別作用2、4、8、12、24和48 h。CCK-8法檢測結果顯示，各濃度及時間梯度組細胞活力無顯著差異，見圖1。

Figure 1. The effects of trimethylamineN-oxide (TMAO) on viability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A: the HUVECs were incubated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (2, 4, 8, 12, 24 and 48 h). Mean±SD.n=3.

圖1 氧化三甲胺對人臍靜脈內皮細胞活力的影響

2 TMAO促進HUVECs氧化應激的增加

用不同濃度(10、30、100和300 μmol/L)的TMAO處理HUVECs 48 h后觀察到，10 μmol/L TMAO作用于HUVECs 48 h即可引起胞內DCFH平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)的增加(P<0.05)，并且隨著TMAO濃度增加，MFI也逐漸升高(P<0.05)，見圖2A；用100 μmol/L TMAO分別處理HUVECs 4、12、24和48 h后觀察到，100 μmol/L TMAO處理HUVECs 24 h和48 h均可引起MFI增加(P<0.05)，而4 h組和12 h組MFI與正常對照組相比無顯著差異，見圖2B。

3 TMAO誘導HUVECs內質網應激的發生

3.1TMAO對IRE-1α磷酸化水平的影響 用30、100和300 μmol/L TMAO處理HUVECs 48 h均可上調IRE-1α磷酸化水平(P<0.05);用100 μmol/L TMAO處理HUVECs 12、24和48 h均可上調IRE-1α磷酸化水平(P<0.05)，其中24 h和48 h組IRE-1α磷酸化水平較正常對照組顯著升高(P<0.01)，見圖3。

3.2TMAO對GRP78/BiP蛋白水平的影響 用30、100和300 μmol/L TMAO處理HUVECs 48 h均可引起GRP78/BiP蛋白水平顯著升高(P<0.05);用100 μmol/L TMAO處理HUVECs 12、24和48 h均可引起GRP78/BiP蛋白水平升高(P<0.05)，其中24 h和48 h組GRP78/BiP蛋白水平較正常對照組顯著升高(P<0.01)，見圖4。

4 STF-083010緩解TMAO引起的HUVECs氧化應激增加

用25 μmol/L的IRE1α特異性抑制劑預處理HUVECs 1 h可緩解TMAO引起的HUVECs氧化應激增加，TMAO組MFI較control組顯著上升(P<0.05)，而TMAO+STF-083010組MFI較TMAO組下降(P<0.05)，見圖5。

討 論

作為心血管疾病傳統危險因素之一的膳食因素，目前正以腸道菌群這一全新的視角重新獲得廣泛的關注。氧化三甲胺作為一種重要的腸道菌群代謝產物，與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關，但其作用機制仍未有定論。有研究表明，TMAO可通過刺激血小板內Ca2+釋放促進血小板聚集，加速血栓形成過程[14]。TMAO可通過快速激活血管內皮細胞和平滑肌細胞內MAPK和NF-κB等信號分子，促進黏附因子的表達[15]。根據這一系列研究，我們推測TMAO可能通過直接促進動脈粥樣斑塊形成或加重血管內皮功能障礙參與到動脈粥樣硬化的發生與發展過程中。而在本研究中，盡管TMAO未表現出對HUVECs活力有顯著影響，但是當作用較長時間(>24 h)，較低濃度的TMAO即可引起原代HUVECs氧化應激的增加，提示TMAO有可能通過促進血管內皮氧化應激的增加參與到動脈粥樣硬化的病理過程中，且這一作用更趨于長期持續的刺激引起細胞的慢性反應。

Figure 2. TrimethylamineN-oxide (TMAO) increased ROS level in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A: the HUVECs were treated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h, and the ROS production was detected by flow cytometric analysis; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (4, 12, 24 and 48 h), and the ROS production was detected by flow cytometric analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 氧化三甲胺促進人臍靜脈內皮細胞氧化應激的增加

內質網應激是由各種理化及生物因素所引起的，以錯誤折疊蛋白堆積為主要表現的內質網結構和功能的損傷狀態，當內質網應激發生時，細胞通過啟動未折疊蛋白質反應UPR降低錯誤折疊蛋白在內質網內的積累，恢復內質網功能并促進細胞的生存。PERK、ATF6及IRE-1的激活均可介導細胞的促生存信號途徑[16-18]。但是，當內質網應激過于嚴重或者長期持續存在時，這3條信號通路的激活同樣可以介導細胞的損傷及凋亡相關信號途徑。有研究表明，內質網應激可通過影響細胞內Ca2+及Ca2+-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ，進而激活NADPH氧化酶，引起細胞內氧化應激的增加[19]。本研究中我們觀察到，TMAO可引起HUVECs IRE-1α磷酸化水平的升高和GRP78/BiP蛋白水平的顯著升高，并且有較為明確的時間或作用濃度節點，進一步提示TMAO對HUVECs的作用是一個長期慢性的過程。

Figure 3. TMAO increased the phosphorylation level of IRE-1α in HUVECs. A: the HUVECs were treated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h, and the phosphorylation level of IRE-1α was detected via Western blot; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (4, 12, 24 and 48 h), and the phosphorylation level of IRE-1α was detected via Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

圖3 氧化三甲胺引起人臍靜脈內皮細胞IRE-1α磷酸化水平升高

Figure 4. TMAO significantly up-regulated the protein level of GRP78/BiP in HUVECs. A: the HUVECs were treated with different concentrations (10, 30, 100 and 300 μmol/L) of TMAO for 48 h, and the protein level of GRP78/BiP was detected via Western blot; B: the HUVECs were treated with TMAO (100 μmol/L) for different periods (4, 12, 24 and 48 h), and the protein level of GRP78/BiP was detected via Western blot. Mean ±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

圖4 氧化三甲胺引起人臍靜脈內皮細胞GRP78/BiP蛋白水平顯著升高

Figure 5. The inhibitor of IRE1α reduced TMAO-induced accumulation of reactive oxygen species (ROS) in HUVECs. A: the ROS production in HUVECs was observed by phase-contrast microscopy; B: the ROS production in HUVECs was detected by flow cytometric analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTMAO group.

圖5 IRE1α抑制劑緩解TMAO引起的HUVECs氧化應激增加

在上述實驗基礎上，為了進一步探討內質網應激是否參與了TMAO促HUVECs氧化應激的過程，本研究觀察了IRE1α特異性抑制劑STF-083010對TMAO促HUVECs氧化應激的影響。在研究中我們觀察到，STF-083010一定程度上緩解了TMAO促HUVECs氧化應激增加的作用，這為深入闡明內質網應激在TMAO促HUVECs氧化應激中的作用提供了新穎的實驗依據。值得注意的是，相同條件下，TMAO引起HUVECs IRE-1α磷酸化水平的升高和GRP78/BiP蛋白水平的升高存在不相稱的情況，而后續實驗IRE1α特異性抑制劑對HUVECs氧化應激的緩解程度同樣存在著一定的限制，二者均提示了PERK和ATF6通路在TMAO促HUVECs氧化應激中可能也起了一定的作用，對3條通路的激活程度及孰占主導有待進一步實驗闡明。內質網應激的過程復雜而多樣，值得今后進一步研究。