清熱利濕方對脂肪肝細胞PI3K/Ark 表達調節研究*

張 巍，邵明亮，苗同國，侯桂英，戴二黑

（石家莊市第五醫院研究所，石家莊 050021）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）目前是全球范圍內重要的公共健康問題。研究顯示，亞洲人中脂肪性肝病的發病率約為總人口數量的四分之一[1]。中國NAFLD 的發病率逐年增高，已成為僅次于病毒性肝炎威脅人類健康的第二大肝病。過度肥胖、高脂血癥、高血壓或糖尿病，伴發其他慢性肝炎的NAFLD 患者，肝細胞內出現脂肪堆積，可能會進一步發展為肝纖維化，轉變為不可逆的肝硬化，甚至肝癌。早期的診斷治療，生活方式干預是逆轉NAFLD 的首要選擇[2]。NAFLD 發生和發展的與營養分解代謝和脂質生物循環有關，因此在此過程中主要的代謝基因、蛋白引起重點關注。線粒體ATP 酶（ATPase）具有調節離子平衡功能，是線粒體呼吸鏈功能損傷的重要標志物，ATPase 上調誘發線粒體DNA（mtDNA）異構，為細胞氧化應激損傷中關鍵環節。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）廣泛存在的脂質激酶，并控制細胞存活、增殖、蛋白質合成、運輸的信號級聯反應多種細胞過程，與細胞生長、凋亡、遷移、代謝、腫瘤增殖等發生密切相關。ATP 以劑量和時間依賴性方式刺激PI3K 的磷酸化[3]。腺苷磷酸酶相關蛋白激酶（Ark）為腺苷單磷酸激活蛋白激酶（AMP）家族成員蛋白激酶（Akt）的下游因子，依賴Akt 的磷酸化過程而激活，為細胞營養缺乏條件下Akt 的底物，介導細胞的存活、增殖和分化。中醫藥治療脂肪性肝病所具有獨特的優勢已為臨床熟知，但是以分子靶向為指導的藥物治療機制還未闡明。本次研究擬探討ATPase 與hs-CRP 是否協同參與肝細胞損傷氧化應激反應，并對清熱利濕方調節肝細胞脂肪變作用與ATPase、hs-CRP、PI3K/Ark 信號通路表達關系進一步探討，以期為脂肪肝的辨證施治提供基礎理論支持。

1 研究對象

1.1 實驗動物造模 選取SD 大鼠60 只，雌性，12 周齡，體質量200～250 g，（許可證號150117）。隨機數字表法分為6 組，高脂模型組10 只、多烯磷脂酰膽堿組10 只、清熱利濕方（高、中、低）劑量組各10 只、正常對照組10 只適應性喂養1 周。

大鼠脂肪肝實驗動物模型采用高脂飼料（基礎飼料+2%膽固醇、10%豬油）喂養6 周。6 周開始清熱利濕組灌胃，分成高、中、低劑量分別給予給予0.3 g/（100 g·d），0.1 g/（100 g·d），0.05 g/（100 g·d）。多烯組給予25 mg/（100 g·d）灌胃12 周后取材。隔夜禁食，腹腔戊巴比妥麻醉，心臟采血，低速離心制備血清。處死大鼠后取出各組肝臟，留做病理評分部分肝臟10%甲醛固定，其余置-80 ℃冰箱冷凍。

1.2 實驗藥物 清熱利濕方主要成分為青黛、郁金、生山楂、澤瀉、決明子、茵陳蒿等均購自河北省樂仁堂醫藥有限公司，經藥師鑒定后使用。將原藥加雙蒸水充分浸泡，在煎藥機中熬制，配制成41.667 g/L 的溶液備用，冀藥制字：Z20051051。超敏急性時相反應蛋白（hs-CRP）、ATPase ELISA 試劑盒，PI3K，Ark 多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司。

2 研究方法

2.1 脂肪肝組織病理判斷標準 取肝左葉同一部位組織修整后固定、脫水、包埋、制作病理切片。NAFLD 的病理學診斷按照NAFLD 活動度積分（NAS）評分。1）NAS 為半定量評分系統規定，肝細胞脂肪變（F）：0 分（＜5%）；1 分（5%～33%）；2 分（34%～66%）；3 分（＞66%）。2）小葉內炎癥（20 倍鏡計數壞死灶）：0 分，無；1 分（＜2 個）；2 分（2～4 個）；3 分（＞4 個）。3）肝細胞氣球樣變：0 分，無；1 分，少見；2 分，多見。

2.2 血清hs-CRP，ATPase 表達觀察 取離心后血清1 mL，觀察各實驗組大鼠血清hs-CRP 及ATPase活性，按ELISA 試劑盒說明分別檢測。各實驗組血脂、肝功能比較采用自動化分析儀檢測甘油三脂（TG），膽固醇（TC）及肝功能（ALT/AST/GGT）判斷脂肪肝細胞炎癥活動程度。

2.3 Western blot 檢測脂肪肝細胞PI3K/Ark 取肝組織5 g 加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗勻漿迅速碾磨。加入組織裂解液RIPA 約500 μL，冰上作用20～30 min，4 ℃離心，12 000 r/min 離心15 min。吸取2 μL 的上清，測定蛋白濃度。其余上清與蛋白（4∶1 的比例）加入緩沖液，瞬時離心放入-20 ℃冰箱凍存備用。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠加入20 μg 蛋白樣品，濃縮膠電泳（恒流28 mA，約1 h）。分離膠電泳15 V/cm（100/120 V）指示劑至分離膠底部時完畢。在轉膜緩沖液中將裁下的凝膠、NC 膜浸泡10 min，從負極到正極按照順序將纖維帕、3 塊濾紙、PAGE 膠、膜、3 塊濾紙逐層鋪好，并且加轉膜緩沖液，轉膜（100 V/200 mA）1 h。封閉液封閉1 h。一抗（PI3K）/Ark）4 ℃過夜。滴加1×三乙醇胺緩沖溶液（TBS）稀釋的HRP 二抗（1∶800），37 ℃，1 h 后ECL 發光顯色。

數據處理通過伯樂凝膠成像系統Gel Doc XR+Image tool 圖像分析軟件讀取目的條帶上測得的激光光密度掃描值，以各組β-actin 條帶的掃描值標化其相應蛋白表達量。

3 統計分析

應用SPSS 20.0 統計軟件統計處理。實驗數據以均數±標準差（）表示，組間兩兩比較若方差齊采用LSD 法，若方差齊采用Duunett's T3 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 常規病理檢查結果比較 12 周模型組常規蘇森精-伊紅（HE）染色，低倍光鏡下觀察以脂變細胞占肝小葉的1/2～2/3 或2/3 以上，細胞增大或腫脹，胞漿內充滿脂滴空泡，肝竇狹窄、極度狹窄甚至閉塞，為造模成功。從低倍鏡下模型組觀察發現，高脂模型組肝細胞呈現腫脹，氣球樣變，伴有中度脂肪變性，呈現脂肪變改變。按照脂肪肝程度評分（F），高脂模型組（5.30±0.14）分，對照組0 分，多烯磷脂酰膽堿組（2.51±0.13）分，清熱利濕低劑量組（4.30±0.51）分，清熱利濕中劑量組（3.61±0.73）分，清熱利濕高劑量組（2.17±0.15）分。經多烯磷脂酰膽堿、清熱利濕方治療，脂肪性變性程度下降，肝細胞脂肪變評分明顯改善，見圖1。

4.2 清熱利濕方對各組肝功能/血脂調節效果 從圖2 可見模型組轉氨酶（ALT）TC 的改變具有相關性（Y=0.026 4X+1.699 4），谷氨酰轉移酶（GGT）與TG 具有相關性（Y=0.102X-1.351 2）。表1 可見，清熱利濕可以有效減低ALT、TC、TG 水平，顯著改善肝功能。其中清熱利濕高劑量組與高脂模型組ALT、TC、TG 比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。清熱利濕中劑量組與模型組谷氨酰轉移酶（GGT）、TG比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

4.3 肝細胞脂肪變性與血清hs-CRP，ATP 水平 從表2 中可以發現，高脂模型組hs-CRP 明顯升高，ATP 顯著下降，hs-CRP 與ATP 水平具有負相關（Y=-2.528 7X+29.347）見圖3。高脂模型組hs-CRP與清熱利濕高劑量組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。清熱利濕高劑量組ATP 與高脂模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.05），其他組別兩兩比較無顯著差異。

4.4 清熱利濕方對各實驗組脂肪肝細胞PI3K/Ark表達比較 根據血清檢測結果，選用模型組、多烯組、清熱利濕高劑量組、清熱利濕中劑量組、清熱利濕低劑量組、進一步進行表達蛋白印跡實驗。圖4，表3 實驗結果可以看出，對照組PI3K，Ark 表達較低，模型組PI3K，Ark 表達量較高，高劑量組與模型組比較PI3K，Ark 表達差異具有統計學意義。

圖1 清熱利濕方對各組脂肪肝細胞作用觀察（低倍鏡100×）

圖2 脂肪肝大鼠血清肝功能與血脂水平相關性觀察

表1 清熱利濕方對各組肝功能/血脂調節效果比較（）

表1 清熱利濕方對各組肝功能/血脂調節效果比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 n ALT（U/L） AST（U/L） GGT（U/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L）清熱利濕低劑量組 10 110.74±5.82 74.60±5.60 56.60±1.00 5.52±0.26 4.69±0.69清熱利濕中劑量組 10 55.00±9.30 68.13±3.55 33.80±0.70* 3.09±0.83 2.23±0.73*清熱利濕高劑量組 10 48.00±5.70* 64.03±3.77 34.70±1.30 2.67±0.93* 1.89±0.46*對照組 10 34.10±2.15 36.00±1.02 24.15±0.85 2.65±0.93 1.15±0.71模型組 10 164.73±13.58 82.90±5.30 63.50±3.80 5.59±0.91 4.94±0.83多烯組 10 64.12±4.02 72.01±3.12 33.54±0.74 3.25±0.84 2.11±0.51

表2 清熱利濕方對肝細胞CRP，ATP 表達比較（）

表2 清熱利濕方對肝細胞CRP，ATP 表達比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 n hs-CRP（mg/L） ATP（mg/L）對照組 10 3.11±0.10 9.10±1.56清熱利濕低劑量組 10 17.99±1.14 5.40±1.91清熱利濕中劑量組 10 16.10±1.03 6.10±0.73清熱利濕高劑量組 10 10.01±1.02* 8.13±0.92*多烯組 10 16.27±0.73 5.06±1.43模型組 10 21.57±1.44* 2.21±0.49*

圖3 脂肪肝大鼠血清hs-CRP 與ATP 相關性

圖4 清熱利濕方對各實驗組PI3K/Ark 表達比較

表3 清熱利濕方對各實驗組PI3K/Ark 光密度比較（）

表3 清熱利濕方對各實驗組PI3K/Ark 光密度比較（）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 n PI3K/actin Ark/actin多烯組 10 0.306±0.01 0.412±0.01清熱利濕高劑量 10 0.288±0.02* 0.301±0.01*清熱利濕中劑量 10 0.574±0.04 0.433±0.02清熱利濕低劑量 10 0.642±0.01 0.451±0.04模型組 10 0.713±0.01 0.501±0.01對照組 10 0.212±0.01 0.204±0.01

5 討論

NAFLD 的發病基礎非常復雜，主要包括遺傳因素、飲食因素、胰島素抵抗、脂肪因子及炎癥因子參與和腸道激素的改變等因素[4-5]。脂肪肝按照傳統醫學辨證屬于“肥氣”“積證”“痞滿”“脅痛”，本病的主要病機為本虛標實。本虛主要是肝陰不足，脾腎氣虛；標實主要為痰濁內蘊夾瘀，致使痰瘀互結而發病[6]。誘因往往起于“過食肥甘厚味”導致慢性營養過剩，久坐不動的生活方式促進新陳代謝失衡。脾虛濕滯，脾虛則運化功能失調，出現以脾胃健運失衡，飲食腐熟不及，脾之清氣不升，胃之濁氣不降，久則損脾礙胃，脾胃之腐熟、運化功能進一步受損[7]。肝疏泄功能失職，情志亦會隨之發生變化，水谷精微輸布失調，內生痰濕，“痰證”“痰濁”“痰癖”痰濕瘀阻互結，痹阻肝臟脈絡而形成脂肪肝，壅塞于肝，形成痰血阻滯，日久生熱，濕熱內蘊，阻滯氣機運行，肝失調達，痰濁聚于肝，日久加重則成肝癖，終致“肝壅”“脅痛”等癥[8-9]。

臨床脂肪肝的治療主要是降脂，增加維生素的攝入量和控制飲食脂肪肝的治療還需要兼顧肝臟病變、血脂異常、肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病。本院在臨床治療中強調審證求因，辨證論治，重視去除根本患病因素，研制出清熱利濕方治療脂肪肝。清熱利濕方中選用青黛、茵陳蒿利膽清熱健脾，柴胡疏肝理氣，郁金活血行氣解郁，涼血利膽，茯苓、澤瀉燥濕化痰，各方相互配伍具有清熱祛濕消痰，健脾消積降脂，發揮益氣活血、祛瘀消痰之功。經過近5 年臨床應用觀察，取得肯定的治療效果。

藥理學研究證實，青黛粉治療實驗性高脂動物，可降低肝中52%TG。青黛所含的豐富的磷脂酰膽堿促進肝中脂肪的氧化作用，顯著降TG，阻止TC在肝內沉積，降低肝內脂質含量，發揮對實驗性動脈粥樣硬化模型性有降脂作用[10]。何首烏主要成分二苯乙烯苷對過氧化玉米所致大鼠脂肪肝動物模型有效，明顯對抗肝功能損害，肝中過氧化脂質含量。決明子蛋白質和蒽酯苷成分，降低高脂血癥大鼠的TC、TG 和低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）[11]。澤瀉影響內源性膽固醇代謝及抑制肝內TG 的合成，影響與TC 有關的酶選擇性抑制外源性TG、TC 的吸收而抑制脂肪肝。由于中醫病機把握準確，治法嚴謹，遣方用藥合理，臨床觀察中發現清熱利濕方能促進肝臟循環，抑制外源性膽固醇的吸收，改善肝臟脂肪代謝，達到治療脂肪肝的目的[12]。

線粒體的能量代謝體系是脂肪性肝病的靶點之一。細胞內線粒體功能是依據獨立的DNA 編碼多肽，合成脂類氧化磷酸化系統所需成分，以及細胞活動必須的能量ATP。線粒體對DNA 損傷的修復能力弱，很容易被氧化應激損傷[13]。NAFLD 模型出現肝細胞線粒體脂質過氧化和細胞能量失衡，釋放大量的hs-CRP 及自由基，引起PI3K/Ark 信號途徑激活，引發肝臟的細胞凋亡，進一步激活肝臟星狀細胞，從而產生肝細胞的炎癥、壞死、纖維化、氧化應激游離原子團產生，以至聚集氧化產物清除失衡。肝細胞中線粒體內氧化反應率的提高，引起活性氧數量增加直接導致ATP 酶形態學改變，脂肪動員障礙，發生代謝紊亂。脂肪性肝病細胞中存在巨型線粒體通過電鏡檢查得以證實。ATPase 基因編碼ATP 合成酶，ATP 酶復合物的重要組成部分。細胞的損害和參與反應的活性氧增加導致ATP 的消耗。本實驗結果顯示隨著對大鼠肝細胞的損傷逐漸加重，大鼠肝細胞線粒體ATPase 減低。清熱高劑量組與模型組大鼠肝細胞ATP 表達存在明顯差異，清熱利濕方治療后，明顯提高表達水平，說明清熱利濕方可以調節肝細胞脂質氧化損傷，減低肝細胞炎癥程度，ATP 合成增強。同時脂肪肝模型大鼠血清中CRP 呈現異常升高，清熱利濕方治療后炎癥過氧化損傷明顯緩解。結果提示清熱利濕方通過降低過氧化損傷因子以及提高抗氧化損傷雙向調節脂肪肝細胞的病理狀態，具有治療作用。

PI3K 信號通路（胰島素受體底物/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B，IRS/PI3K/Akt）是胰島素信號通路中的經典通路。已有大量研究表明該信號通路調控機體的營養代謝活動，促使機體糖原、脂肪和蛋白質的合成[14]。隨著脂肪酸β-氧化的減少脂肪生成增加導致肝細胞中TG 的積累，其與活性氧水平的增加相結合，導致脂肪性肝炎患者的胰島素抵抗。線粒體應激和損傷促進細胞死亡，肝纖維化，炎癥和對病毒感染的先天免疫反應。肝組織中觀察到超微結構線粒體損傷，線粒體動力學改變，呼吸鏈復合物活性降低以及合成三磷酸腺苷的能力受損。PI3K/Ark 信號途徑激活在脂類異常、氧化代謝導致損傷中發揮重要作用。PI3K 通路激活引起磷酸化，可以激活線粒體ATP 鉀通道開放，減少鈣離子通道開放，抑制線粒體Caspase-3 的活化二者協同作用抑制肝細胞的凋亡[15]。

實驗結果可以看出，模型組及實驗各組呈現不同程度PI3K/Ark 表達升高，清熱利濕方治療可以有效改善PI3K/Ark 表達，抑制肝細胞炎癥活動，與線粒體功能相關聯。清熱利濕方通過調節肝細胞線粒體功能，改善肝細胞PI3K/Ark 由于脂類代謝異常形成的過氧化損傷，降低炎性介質CRP，促進肝細胞功能的恢復，具備一定的治療效果。筆者將進一步分析清熱利濕方中的有效成分，深入的研究其治療作用機制，促進臨床的應用推廣。