金槐和米槐主流品種花粉形態(tài)研究

史艷財 韋宇靜 鄒蓉 唐健民 蔣運生 熊忠臣

摘 要：該研究以6個金槐品種和2個米槐品種的花粉為材料，采用美國卡爾蔡司EVO18掃描電鏡對其極面、赤道面、外壁紋飾等形態(tài)特征進行了觀察，并對金槐、米槐品種間的親緣關(guān)系進行了分析。結(jié)果表明：（1）金槐和米槐花粉的共有特征有極面觀為三裂圓形，極面光滑;具3孔溝，溝較窄且達兩極;溝緣中部外凸，具顆粒狀突起;溝在極面上沒有交會，形成寬大的溝界極區(qū)。（2）金槐的花粉粒為長球形，金槐J6的極軸最長，金槐J2的極軸最短，極軸長/赤道軸長表現(xiàn)的規(guī)律與極軸長相一致;網(wǎng)眼直徑最大的是金槐J2，最小的是金槐J5;網(wǎng)眼密度最大的是金槐J6，最小的是金槐J2。（3）米槐的花粉粒為近圓球形，極軸長和極軸長/赤道軸長明顯小于金槐，但其赤道軸長大于金槐;雙季米槐的赤道軸長、極軸長、極軸長/赤道軸長、網(wǎng)眼密度都小于單季米槐。（4）8個品種可分為3組，金槐J4、金槐J1和金槐J6 3個品種親緣關(guān)系較近，金槐J5、金槐J3和金槐J2 3個品種親緣關(guān)系較近，單季米槐和雙季米槐2個品種親緣關(guān)系較近。花粉形態(tài)是鑒別金槐和米槐兩大類品種的重要根據(jù)，并可為進一步的品種劃分提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：金槐，米槐，花粉，掃描電鏡，親緣關(guān)系

中圖分類號：Q938文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）01-0024-07

Abstract：The pollen morphology of six Sophora japonica ‘Jinhuai and two? S. japonica ‘Mihuai varieties were observed by scanning electron microscopy （SEM），and the relationship was analyzed. The results were as follows：（1） The common characteristics of the pollen of Sophora japonica ‘Jinhuai and S. japonica ‘Mihuai included that the polar surface was three-lobed round and the polar surface was smooth; three narrow hole groove reached two poles; middle part of the groove edge was convex and granular protrusions; the groove did not meet on the polar surface，forming a wide trench boundary. （2） The pollen of S. japonica ‘Jinhuai were nearly spherical，the polar axis of Jinhuai J6 was the longest，and that of Jinhuai J2 was the shortest，the law of polar axis/equator axis was consistent with polar axis. The diameter of the mesh of Jinhuai J2 was the largest，and that of Jinhuai J5 was the the smallest; Mesh density of Jinhuai J6 was the largest，and that of Jinhuai J2 was the smallest. （3） The pollen grains of S. japonica ‘Mihuai were nearly spherical，and the polar axis/equator axis was significantly smaller than that of S. japonica ‘Jinhuai，but the equatorial axis was larger than that of S. japonica ‘Jinhuai; the equatorial axis，polar axis，polar axis/equator axis and mesh density of S. japonica ‘Shuangjimihuai were lower than those of S. japonica ‘Danjimihuai. （4） The eight varieties could be divided into three groups，Jinhuai J4，Jinhuai J1 and Jinhuai J6 were closely related to each other，Jinhuai J5，Jinhuai J3 and Jinhuai J2 were closely related to each other，Shuangjimihuai and Danjimihuai were closely related to each other. It can be concluded that pollen morphology was an important character for identifying S. japonica ‘Jinhuai and S. japonica ‘Mihuai，and it can be an important basis for further classification of varieties.

Key words：Sophora japonica ‘Jinhuai，S. japonica ‘Mihuai，pollen，SEM，relative relationships

豆科槐屬植物槐樹（Sophora japonica）的干燥花蕾被稱為槐米，是一種富含蘆丁、黃堿素等成分的特色中藥材（楊娜等，2015）。目前，山西運城市和廣西全州縣是我國槐米的主產(chǎn)區(qū)，槐米產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的80%以上。廣西全州縣憑借其獨特的土質(zhì)、氣候等自然條件孕育了獨特的金槐種質(zhì)資源，生產(chǎn)的槐米被稱為金槐米（槐米呈金黃色而得名），其蘆丁含量高達35%～40%，遠高于山西槐米蘆丁含量（15%～25%）和《中國藥典》（2005年版）15%的標準限度（李鋒等，2009;舒文將等，2017）。目前，科研人員已從野生金槐種質(zhì)資源中選育出6個金槐良種在廣西推廣種植。相對而言，山西的品種較為單一，主要是單季米槐和雙季米槐兩個品種。近年來，商品性引種日益頻繁，經(jīng)常出現(xiàn)一個種植園中米槐、金槐混種的現(xiàn)象，而以上品種的劃分主要是依據(jù)生物學性狀、開花物候、產(chǎn)量等方面的細微差別，品種間的區(qū)分度較低，部分品種劃分甚至還存在一定的爭議。此外，不同品種長期混種，勢必會產(chǎn)生種間雜交，加劇品種間鑒定的難度。因此，從孢粉學等其他角度對槐米主流品種的親緣關(guān)系、起源和演化等進行研究具有非常重要的意義。

花粉在植物生長發(fā)育過程中出現(xiàn)的最晚，生活期較短，受環(huán)境因子影響較小，形態(tài)特征與其遺傳特性高度相關(guān)，可為植物起源、分類、演化等研究提供有力證據(jù)，有助于解決植物在分類系統(tǒng)上的地位問題（劉鵬等，2015;唐艷等，2018a，2018b;史小花等，2018）。此外，花粉微觀分析操作簡單、周期短、可靠性強。因此，花粉形態(tài)分析已在植物品種和物種鑒定中廣泛應用。國內(nèi)已對槐屬的花粉形態(tài)進行了初步研究，如趙燕等（2007）對國槐及其變種（龍爪槐）和變異（聊紅槐、蝴蝶槐）類型的花粉形態(tài)進行了比較研究;楊德奎等（2005）對山東槐屬3種1變型的花粉形態(tài)進行了研究;劉德光等（2007）對香花槐與刺槐的花粉形態(tài)進行了比較。但以上研究所涉及的僅是槐屬的少數(shù)變種和變異類型，且都是觀賞樹種，而對槐米生產(chǎn)的主流品種金槐和米槐花粉形態(tài)的研究還未見報道。因此，本研究從花粉形態(tài)特征角度對金槐、米槐進行分析，旨在為不同品種的分類鑒定、遺傳演化及親緣關(guān)系研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

本研究所用的金槐（6個品種）和米槐（2個品種）的花粉采自廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所種質(zhì)資源圃和山西省運城市鹽湖區(qū)雙季米槐種植核心示范區(qū)，共計8份材料（表1）。

選擇生長健壯、無病蟲害的植株，于盛花期采集樹冠外圍中上部即將開放的花蕾，裝于紙質(zhì)樣品袋中，置于裝有硅膠的封口袋中常溫保存。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 花粉掃描電鏡觀察 采用消毒的竹牙簽挑取少量的花粉撒于粘有導電膠的樣品臺上，在離子濺射儀上進行真空噴金鍍膜，然后在掃描電鏡?1-4. 金槐J1; 5-8. 金槐J2; 9-12. 金槐J3; 13-16. 金槐J4。每個物種花粉掃描電鏡結(jié)果依次為群體（×800），赤道面觀（×3 000），極面觀（×3 000），孔溝（×3 000）。下同。

1-4. Jinhuai J1; 5-8. Jinhuai J2; 9-12. Jinhuai J3; 13-16. Jinhuai J4. SEM observation results of pollen morphology every specie were pollen grain view（×800），equatorial view（×3 000），polar view（×3 000），colporate（×3 000）. The same below.

下進行觀察。選擇典型、清晰的視野進行觀察、拍照。采用AxioVision Rel.4.8軟件測量花粉的極軸長、赤道軸長、網(wǎng)眼直徑以及網(wǎng)眼密度。

1.2.2 花粉定量特征統(tǒng)計 每份材料選取20粒代表性的花粉粒進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用SPSS20.0軟件對極軸長、赤道軸長、網(wǎng)眼直徑以及網(wǎng)眼密度4個定量特征數(shù)據(jù)進行標準化，并進行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉性狀

金槐的花粉粒為長球形，米槐的花粉粒為近圓球形，兩者的共有特征包括：極面觀為三裂圓形，極面光滑;具3孔溝，溝較窄且達兩極，溝緣中部外凸，具顆粒狀突起;溝在極面上沒有交會，形成寬大的溝界極區(qū)（圖1，圖2）。

2.2 花粉的大小

金槐花粉以單粉粒形式存在，花粉粒為長球形，金槐J6的極軸最長，為20.64 μm，金槐J2的極軸最短，為18.92 μm;極軸長/赤道軸長表現(xiàn)的規(guī)律與極軸相一致，都為金槐J6最大，金槐J2最小。

米槐花粉粒為圓球形，極軸長和極軸長/赤道軸長明顯小于金槐品種，但其赤道軸長大于金槐花粉。此外，雙季米槐的赤道軸長、極軸長、極軸長/赤道軸長都小于單季米槐（表1）。

2.3 花粉的外壁紋飾

金槐和米槐花粉的外壁紋飾都為網(wǎng)狀紋飾，呈圓形或近圓形，由網(wǎng)眼和凸起的網(wǎng)脊組成。金槐的花粉中，網(wǎng)眼直徑最大的是金槐J2，為0.45 μm，最小的是金槐J5，為0.24 μm;網(wǎng)眼密度最大的是金槐J6，為6.22個·μm-2，網(wǎng)眼最小的是金槐J2，為2.21個·μm-2。

米槐花粉網(wǎng)眼直徑明顯小于金槐，且單季米槐和雙季米槐的花粉的網(wǎng)眼直徑基本一致，都為0.21 μm;雙季米槐的網(wǎng)眼密度小于單季米槐（表1）。

2.4 聚類結(jié)果分析

基于不同品種的花粉性狀，采用SPSS軟件對8個品種進行了系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3所示。8個品種可以分為3組，第一組包括金槐J4、金槐J1和金槐J6 3個品種;第二組包括金槐J5、金槐J3和金槐J2 3個品種;第三組包括單季米槐和雙季米槐兩個品種。

3 討論與結(jié)論

研究表明，植物花粉具有科、屬的共同特征。本研究顯示，金槐、米槐花粉極面觀為三裂圓形，極面光滑;具3孔溝，溝較窄且達兩極，溝緣中部外凸，具顆粒狀突起;溝在極面上沒有交會，形成寬大的溝界極區(qū)，這些反映了其科內(nèi)的共有屬性，該結(jié)果與其他研究結(jié)果相一致（楊德奎等，2005;趙燕等，2007）。與此同時，各種植物花粉的性狀千變?nèi)f化，構(gòu)造各不相同，因而花粉的形態(tài)特征是鑒定植物屬、種的主要依據(jù)（羅樂等，2017）。本研究中，金槐的花粉全部為長球形，而米槐的花粉粒為近圓球形，除赤道軸長大于金槐花粉外，極軸長、極軸長/赤道軸長、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)眼密度都明顯小于金槐品種。因此，除生物學性狀特征外，花粉性狀也是區(qū)別金槐、米槐兩類品種的主要特征。

花粉外壁紋飾是表征花粉進化程度的一個重要指標，一般是由簡單平滑向復雜粗糙進化，常見的進化方向是龜裂狀→孔穴或小溝→顆粒狀突起→棒刺狀→網(wǎng)狀、皺波狀及條紋狀（Walker，1974）。花粉的進化途徑通常是較原始的花粉為大型、網(wǎng)眼大，較進化的花粉為小型、網(wǎng)眼小。本研究結(jié)果顯示，金槐和米槐花粉的外壁紋飾都為網(wǎng)狀紋飾，呈圓形或近圓形，由網(wǎng)眼和凸起的網(wǎng)脊組成。因此，本研究中的8個品種屬較為進化的類群。此外，8個品種中單季米槐和雙季米槐的花粉最小;金槐J5、金槐J3和金槐J2 3個品種中等;金槐J4、金槐J1和金槐J6 3個品種最大，由此推測單季米槐和雙季米槐最為進化（雙季米槐較單季米槐進化）;金槐J5、金槐J3和金槐J2 3個品種較為進化;金槐J4、金槐J1和金槐J6 3個品種最為原始。一般而言，植物進化程度越高，其遺傳多樣性越豐富，越易通過遺傳突變等方式形成新的物種。本研究中進化程度最高的米槐僅有兩個品種，而相對較為原始的金槐則有6個品種，造成這種情況的主要原因可能是由于人為選擇過程的不同。廣西植物研究所金槐團隊長期從事于金槐研究，本研究中所用的6個品種是該團隊綜合不同類型金槐的生物學性特、經(jīng)濟性狀等方面的考量從豐富的金槐種質(zhì)資源中選育而來。而米槐的研究相對較為緩慢，無專業(yè)的研究隊伍對其種質(zhì)資源進行系統(tǒng)的梳理、篩選，所用品種都是從以前種植園中直接采穗嫁接而成。由此可知，進化度高的米槐可能孕育有豐富資源，需在以后的研究中對其種質(zhì)進行深入、系統(tǒng)的整理和挖掘。

花粉形態(tài)的相似性可為不同品種間親緣關(guān)系的判斷提供依據(jù)。基于花粉的極軸長、赤道軸長、極軸長/赤道軸長、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)眼密度5個性狀，金槐和米槐的8個品種可以分為3組：金槐J4、金槐J1和金槐J6 3個品種親緣關(guān)系較近;金槐J5、金槐J3和金槐J2 3個品種親緣關(guān)系較近;單季米槐和雙季米槐親緣關(guān)系較近。聚類結(jié)果表明，米槐與金槐品種的親緣關(guān)系相對較遠，兩者間存在種質(zhì)滲透的可能性較小。

不同金槐品種花粉表面的紋飾均為網(wǎng)狀紋飾，但不同品種在網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)眼密度上差異明顯，可以作為品種分類依據(jù)的重要補充。如，金槐J4、金槐J5和金槐J6 3個品種間植物學性狀差異較小，不易區(qū)分。但根據(jù)花粉網(wǎng)眼密度卻可以很好地區(qū)分：金槐J6花粉粒長、極軸長/赤道軸長、網(wǎng)眼密度最大，金槐J4次之，金槐J5最小。

本研究中花粉形態(tài)特征對金槐和米槐的分類及親緣關(guān)系的鑒定提供了一定的依據(jù)，但需進一步結(jié)合細胞學、解剖學、基因組學等方面進行更加深入的研究。

參考文獻：

LI F，TANG H，WEI X，et al.，2009. The current status，problems and development measures of Golden Sophora japhora in Quanzhou County of Guangxi [J]. J Guangxi Acad Sci，25（2）：130-134. [李鋒，唐輝，韋霄，等，2009. 廣西全州縣金槐生產(chǎn)存在的問題及發(fā)展對策 [J]. 廣西科學院學報，25（2）：130-134.]

LIU DG，HU HL，TANG SY，et al.，2007. Observation and comparson based scan electron microscope on pollen morpho-logy of Robinia idaho with the Robinia pseudoacacia Linn[J]. Anhui Agric Sci Bull，13（22）：14-16. [劉德光，胡蕙露，湯士勇，等，2007. 香花槐與刺槐花粉形態(tài)的電鏡觀察及比較 [J]. 安徽農(nóng)學通報，13（22）：14-16.]

LIU P，MA LC，WANG Y，et al.，2015. Observation of pollen morphology of 16 Vicia accessions using scanning electron microscopy[J]. Acta Pratac Sin，24（1）：107-114. [劉鵬，馬利超，王宇，等，2015. 16種野豌豆屬植物花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察[J]. 草業(yè)學報，24（1）：107-114.]

LUO L，ZHANG QX，YU C，et al.，2017. Pollen morphology analysis of 29 Rosa germplasm [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，37（5）：885-894. [羅樂，張啟翔，于超，等，2017. 29個薔薇屬植物的孢粉學研究 [J]. 西北植物學報，37（5）：885-894.]

SHI XH，ZOU QC，JIN L，et al.，2018. Comparative research on pollen fertility and morphology of Helleborus thibetanus[J]. Mol Plant Breed，16（5）：1690-1697. [史小華，鄒清成，金亮，等，2018. 鐵筷子花粉育性與形態(tài)比較研究[J]. 分子植物育種，16（5）：1690-1697.]

SHU WL，SHI YC，JIANG YS，et al.，2017. Sophora japonica germplasm resources in Guangxi[J]. Chin J Exp Trad Med Form，23（15）：53-59. [舒文將，史艷財，蔣運生，等，2017. 廣西槐種質(zhì)資源調(diào)查[J]. 中國實驗方劑學雜志，23（15）：53-59.]

TANG Y，WU XX，DENG CL，et al.，2018. Preliminary observation on pollen morphology of Shagan （Citrus nobilis） [J]. Guihaia，38（2）：250-259. [唐艷，武曉曉，鄧崇玲，等，2018. 沙柑花粉形態(tài)觀察研究 [J]. 廣西植物，38（2）： 250-259.]

TANG Y，WU XX，LIU BH，et al.，2018. Study on pollen morphology andsystematics of wild Citrus resources in Guposhan Mountain in Guangxi Province[J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin，38（6）：1065-1071. [唐艷，武曉曉，劉冰浩，等，2018. 廣西姑婆山野生柑橘資源花粉形態(tài)觀察及其系統(tǒng)分類學研究[J]. 西北植物學報，38（6）：1065-1071.]

WALKER JW，1974. Evolution of exine structure in the pollen of primitive angiosperms [J]. Am J Bot，61：891-902.

YANG DK，GUO XY，WANG SE，et al.，2005. Study pollen submicroscopic morphology of Sophora L. from Shandong [J]. Guangxi Sci，12（2）：158-160. [楊德奎，郭小燕，王善娥，等，2005. 山東槐屬植物的花粉亞顯微形態(tài)觀察[J]. 廣西科學，12（2）：158-160.]

YANG N，ZHU KM，GU SJ，2015. The research progress on the extraction method of rutin from Sophara japonica L.[J]. Lishizhen Mat Med Res，21（12）：3340-3341. [楊娜，朱開梅，顧生玖，2015. 從槐米中提取槲皮素方法的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥，21（12）：3340-3341.]

ZHAO Y，HOU GL，ZHANG XS，et al.，2007. A comparative study on pollen morphology of variety and form of Sophora japonica L. in Liaocheng[J]. J Liaocheng Univ （Nat Sci Ed），20（1）：53-55. [趙燕，侯桂玲，張秀省，等，2007. 國槐及其變種、變型花粉形態(tài)的比較研究[J]. 聊城大學學報（自然科學版），20（1）：53-55.]

（責任編輯 何永艷）