色素萬(wàn)壽菊試管苗玻璃化控制的研究

吳麗芳 田雪蓮 魏曉梅 路小春 錢(qián)紹方 桂寶林

摘 ?要：以色素萬(wàn)壽菊帶腋芽的莖段為外植體，研究離體快繁中蔗糖、AgNO₃、瓊脂、植物凝膠、活性炭及不同封口材料對(duì)芽增殖及玻璃苗產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示：30 g/L蔗糖適合萬(wàn)壽菊幼苗的生長(zhǎng)，玻璃化率隨蔗糖濃度（10～60 g/L）的增加而減少，60?g/L的蔗糖玻璃化率僅9.13%;AgNO₃有抑制玻璃苗發(fā)生作用，5.0?g/L?AgNO₃可使玻璃化率低至9.81%;活性炭的用量對(duì)玻璃化影響最為明顯，5.0?g/L活性炭可使玻璃化率高達(dá)38.18%;瓊脂和植物凝膠對(duì)芽的增殖及玻璃化發(fā)生表現(xiàn)相同的趨勢(shì)，低濃度時(shí)有利于芽的增殖，高濃度可有效防止玻璃化發(fā)生，10?g/L的瓊脂玻璃化率低至8.31%;2.0?g/L的植物凝膠芽增殖系數(shù)高達(dá)3.35，5.0?g/L植物凝膠玻璃化率低至6.67%;棉花塞+雙層牛皮紙+棉線封口時(shí)，芽增殖系數(shù)高達(dá)3.24，玻璃化率低至8.46%。

關(guān)鍵詞：色素萬(wàn)壽菊;試管苗;玻璃化;增殖中圖分類號(hào)：Q949.783.5??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Vitrificationof?Regenerated Shoots?of Tagetes erecta?L.in Pigment Marigold

WU Lifang¹， TIAN Xuelian¹， WEI Xiaomei¹， LU Xiaochun¹， QIAN Shaofang²， GUI Baolin³

1. College of Biological Resource and Food Engineering， Qujing Normal University / Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing， Yunnan 655011，?China;?2. Qujing BoHao Biotech Co.， Ltd.， Zhanyi， Yunnan 655331， China;?3. Soil Fertilizer Workstation， Xundian Agricultural Bureau，?Xundian，?Yunnan 650224， China

Abstract： The?stem with axillary buds fromTagetes erecta L.?was used as the explants， and the effects of sucrose， AgNO₃， agar， plant gel， activated carbon and different sealing materials on shoot proliferation and vitrification were studied in this paper. The results showed that 30?g/L sucrose was suitable for the growth of the plantlet. The vitrification rate decreased with sucrose concentration increased （10-60 g/L）. The vitrification rate was only 9.13% with sucrose concentration at 60?g/L.?AgNO₃had the effect of inhibiting the growth of glass seedlings. 5.0?g/L AgNO₃ had a vitrification rate?as low as 9.81%. The quantity of activated carbon （AC） was most obvious to vitrification， 5.0?g/L AC was most serious for vitrification， and the vitrification rate was as high as 38.18%. Agar and plant gels showed a same trend for bud proliferation and vitrification. Low concentration was conducive for shoot proliferation and high concentration could effectively prevent the occurrence of vitrification. Vitrification rate was the lowest， only 8.31% for 10 g/L agar. The shoot proliferation coefficient was as high as 3.35 for 2.0?g/L plant gel， and the vitrification rate was as low as 6.67% for 5.0?g/L plant gel. When cotton plug plus double kraft paper plus cotton thread was used as the sealing materials， the shoot proliferation coefficient was as high as 3.24 and the vitrification rate was as low as 8.46%.

Keywords：pigment marigold; regenerated shoots; vitrification; proliferation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.016

萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L.）屬菊科萬(wàn)壽菊屬一年生植物，原產(chǎn)于墨西哥，早在1700年我國(guó)華南就有記載。色素萬(wàn)壽菊花瓣是提取植物性源葉黃素最理想的原材料之一，被作為經(jīng)濟(jì)作物大量栽種，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于多數(shù)常規(guī)經(jīng)濟(jì)作物^[1]。我國(guó)是世界上色素萬(wàn)壽菊原材料主要栽培國(guó)，其種植面積占世界總種植面積的1/3左右，但仍滿足不了市場(chǎng)的需求。國(guó)內(nèi)天然葉黃素精油市場(chǎng)需求量每年約10萬(wàn)t以上，而實(shí)際產(chǎn)量不足6 kt，隨著市場(chǎng)發(fā)展，這種天然葉黃素的需求將會(huì)越來(lái)越大，開(kāi)發(fā)潛能也必會(huì)十分廣闊。我國(guó)在萬(wàn)壽菊育種研究方面稍顯滯后，提取葉黃素的專用植物資源及品種匱乏;目前雖對(duì)完全依賴進(jìn)口種子的局面有所改善，但仍缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)品種，可用品種來(lái)源單一，多數(shù)還是常規(guī)品種種子，其色素含量比較有限，多在16‰左右，而雜交品種色素含量高達(dá)19‰～22‰，色素含量每增加1個(gè)千分點(diǎn)，價(jià)格將提高500元以上，因此培育色素萬(wàn)壽菊雜交種對(duì)于萬(wàn)壽菊產(chǎn)業(yè)具有重要意義^[2]。萬(wàn)壽菊雜交育種過(guò)程中，種質(zhì)資源狹窄，母本資源中雄性不育系來(lái)源有限，短期內(nèi)滿足不了育種的大量需求，組織培養(yǎng)技術(shù)可在短期內(nèi)快速擴(kuò)繁出大量育種材料，可為萬(wàn)壽菊新品種選育提供資源基礎(chǔ)。但色素萬(wàn)壽菊組織培養(yǎng)中，存在著難以克服的難題——玻璃化現(xiàn)象。

試管苗玻璃化是指組織培養(yǎng)過(guò)程中特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈全透明或半透明狀等外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。形態(tài)上玻璃花苗水水漬化、株形矮小腫脹，節(jié)間短或幾乎沒(méi)有，葉表面縮小或增大，葉片皺縮并縱向卷曲，脆弱易破碎，細(xì)胞中含水量高，葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素等含量低，生理生化代謝紊亂，分化能力低，增殖困難，移栽后難以成活^[3-5]，常影響組培苗的質(zhì)量及規(guī)?；a(chǎn)。自Debergh等^[6]對(duì)組織培養(yǎng)系統(tǒng)研究中提出“玻璃化”一詞以來(lái)，人們對(duì)玻璃化發(fā)生的原因^[7]、玻璃苗的解剖特征^[8]、生理特性^[9]等都做了一些研究工作，但對(duì)玻璃化發(fā)生機(jī)理的研究并沒(méi)有得出可定結(jié)論。玻璃化試管苗CAT（catalase）、SOD（superoxide dismutase）、 POD（peroxidase）活性比正常試管苗高^[10]，馬婧等^[11]等對(duì)老山芹正常試管苗與玻璃苗的對(duì)比分析得出，玻璃化苗淀粉含量、可溶性蛋白、總?cè)~綠素含量和干物質(zhì)積累率降低，而可溶性糖含量比正常苗高。張琳等^[12]研究認(rèn)為，大蒜試管苗玻璃化是ROS產(chǎn)生所致，且進(jìn)一步研究認(rèn)為質(zhì)外體是最先感受外源H₂O₂脅迫的細(xì)胞器^[13]。導(dǎo)致玻璃化苗發(fā)生的因素非常多，不同植物或是同一植物不同器官、組織其主導(dǎo)影響因素也各有差異，至今尚未找到一個(gè)普遍適用的控制措施和行之有效的解決方法，因此仍需對(duì)玻璃化現(xiàn)象進(jìn)行更系統(tǒng)和深入的研究?；诖?，本研究利用前期試驗(yàn)篩選的培養(yǎng)基，通過(guò)比較蔗糖、封口材料、固化劑、抗氧化劑和吸附劑及添加物AgNO₃對(duì)玻璃苗產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，以期找到萬(wàn)壽菊組織培養(yǎng)過(guò)程中玻璃化防止措施，為建立色素萬(wàn)壽菊高效再生體系提供依據(jù)。

1??材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)材料取自云南曲靖博浩生物科技股份有限公司大棚內(nèi)育苗30～45?d萬(wàn)壽菊母本資源B_1-1植株帶腋芽的莖段。

1.2?方法

1.2.1 ?外植體表面消毒??將取來(lái)的材料自來(lái)水下沖洗20 min，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1% HgCl₂消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4～6次后吸干備用。試驗(yàn)使用的瓊脂（500 g/瓶，強(qiáng)度1200 g/cm²）和植物凝膠（100 g/瓶，植物細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，均為分析純。

1.2.2?試管苗培養(yǎng)??將帶腋芽莖段接種于MS+?1.0?mg/L?6-BA+0.5?mg/L?NAA+30 g/L蔗糖+7?g/L瓊脂（pH 5.8）培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種3～4個(gè)莖段，20 mmol/（m²·s）光下培養(yǎng)，光照16 h/d，溫度（25±1）℃。培養(yǎng)30 d后，獲得的試管苗用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理 ?試驗(yàn)設(shè)置6組不同處理：（1）對(duì)照（CK）：以MS+1.0?mg/L?6-BA + 0.5 mg/L?NAA+30 g/L?蔗糖+7 g/L瓊脂（pH 5.8）為基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（2）蔗糖處理組：在MS+1.0?mg/L?6-BA + 0.5 mg/L?NAA?+7 g/L瓊脂（pH 5.8）培養(yǎng)基中分別加入蔗糖10、20、40、50、60 g/L;（3）AgNO₃處理組：分別在基本培養(yǎng)基中添加AgNO₃0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L;（4）活性炭（AC）處理組：分別在基本培養(yǎng)基中添加AC?1.0、2.0、3.0、4.0、5.0?g/L;（5）固化劑處理組：分別在基本培養(yǎng)基中添加瓊脂6.0、8.0、9.0、10.0?g/L，植物凝膠2.0、3.0、4.0、5.0?g/L;（6）封口材料處理組：用罐頭瓶塑料蓋、封口膜+橡皮筋、棉花塞+雙層牛皮紙+棉線作為封口材料。試驗(yàn)中其余處理均用封口膜+棉線為封口材料，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10瓶，每瓶接種試管苗3～5株。培養(yǎng)條件同1.2.1。芽增殖系數(shù)和玻璃化苗率計(jì)算公式如下：

活性炭對(duì)克服試管苗玻璃化有明顯的效果，毛俊紅^[21]在對(duì)牡丹研究中，添加6?g/L活性炭和3?g/L?PVP可顯著抑制牡丹玻璃苗。饒雪琴等^[22]添加0.3%的活性炭，可使番木瓜玻璃化率明顯降低。李娜等^[23]在色素萬(wàn)壽菊的研究中得出，活性炭含量在0～0.1%時(shí)，能夠明顯降低玻璃化程度，而從0.1%增加到0.5%時(shí)，玻璃化程度明顯增高。本研究中，與對(duì)照相比，1.0?mg/L活性炭使玻璃化率降低了，而高于1.0?mg/L的活性炭增加了萬(wàn)壽菊的玻璃化，5.0?g/L?活性炭產(chǎn)生的玻璃化現(xiàn)象最為嚴(yán)重，玻璃化率高達(dá)38.18%。組織培養(yǎng)中，活性炭使用有利也有弊，一方面可以吸附有毒有害物質(zhì)，但同時(shí)吸附作用無(wú)選擇性，使用量不當(dāng)時(shí)，吸附了培養(yǎng)基中鐵鹽和維生素等與玻璃化密切相關(guān)的物質(zhì)從而增加玻璃化率。

固化劑瓊脂和植物凝膠通過(guò)影響培養(yǎng)體系的襯質(zhì)勢(shì)而影響組培苗的玻璃化。固化劑濃度太低，培養(yǎng)基凝固性不好，水分過(guò)多，易導(dǎo)致玻璃化發(fā)生，濃度過(guò)高，培養(yǎng)基過(guò)硬，培養(yǎng)基內(nèi)水分少，培養(yǎng)物難以吸收營(yíng)養(yǎng)也影響組培苗的生長(zhǎng)。本研究認(rèn)為7.0?g/L的瓊脂芽增殖系數(shù)最高，為2.88，10?g/L的瓊脂玻璃化率最低，僅8.31%;2.0?g/L的植物凝膠芽增殖系數(shù)高達(dá)3.35，5.0 g/L植物凝膠玻璃化率低至6.67%。從經(jīng)濟(jì)角度及培養(yǎng)效果考慮，植物凝膠價(jià)格比瓊脂要高，使用瓊脂成本會(huì)更低。

封口材料影響培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的濕度和通氣狀況，透氣性好的封口材料既能防治細(xì)菌和真菌孢子進(jìn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，又能達(dá)到瓶?jī)?nèi)外空氣交換的目的，可降低玻璃苗形成幾率。高疆生等^[24]采用棉塞有效地降低了香石竹玻璃化。本文對(duì)塑料蓋、封口膜+橡皮筋、棉花塞+雙層牛皮紙+棉線進(jìn)行對(duì)比研究，得出棉花塞+雙層牛皮紙+棉線封口可使萬(wàn)壽菊芽增殖系數(shù)高達(dá)3.24，玻璃化率低至8.46%。

綜上所述，蔗糖濃度對(duì)色素萬(wàn)壽菊試管苗增殖及玻璃化有一定影響，30～40?g/L蔗糖適宜萬(wàn)壽菊試管苗生長(zhǎng)、增殖，60?g/L是降低色素萬(wàn)壽菊試管苗玻璃化的適宜濃度。5.0?g/L AgNO₃可有效將萬(wàn)壽菊試管苗玻璃化率降低至9.81%;高濃度的瓊脂和植物凝膠均可降低萬(wàn)壽菊試管苗玻璃化率，但從成本考慮，使用瓊脂更經(jīng)濟(jì)。活性炭的濃度對(duì)不同植物材料有很大差異，色素萬(wàn)壽菊中不宜使用過(guò)高濃度的活性炭，建議濃度在0～?1.0?g/L。

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