馬蹄蓮花粉活力鑒定與貯藏影響因子研究

李紫薇 郭彥兵 張琪 吳紅芝

摘 ?要：以馬蹄蓮不同品種的花粉為材料，研究馬蹄蓮花粉活力檢測的適宜方法和貯藏影響因子。比較了TTC、Lugols?染色液、亞甲基藍、醋酸洋紅4種染色法和離體培養法鑒定馬蹄蓮花粉活力的效果，以及花粉干燥時間（含水量）、貯藏溫度、預凍方法、解凍方法對花粉貯藏的影響。結果表明：所選用的4種染色法中，TTC法能將馬蹄蓮花粉染成深紅、淺紅、粉紅，從而區分出花粉有無活力及活力的強弱;Lugols 染色液、醋酸洋紅不能使花粉染色;亞甲基藍將所有花粉染成同一顏色;所以除TTC法外均不適合馬蹄蓮花粉活力的鑒定。離體培養法培養24 h可以較好鑒定馬蹄蓮花粉活力，其最佳培養基配方為80 g/L蔗糖+0.2?g/L硼酸+0.3 g/L硝酸鈣。馬蹄蓮花粉的適宜干燥條件是室溫下干燥27 h，之后不需任何預凍處理直接放入冰箱，最適解凍方式是37?℃水浴2?min。不同貯藏溫度下馬蹄蓮花粉活力變化存在明顯差異，試驗溫度中以-80?℃的貯藏效果最好，貯藏61?d后仍能保持40%以上的活力，其次是-20?℃貯藏，然后是室溫，4?℃貯藏效果最差。綜上所述，TTC染色法和離體培養法是馬蹄蓮花粉活力測定的適宜方法，-80?℃的低溫可明顯延長馬蹄蓮花粉的貯藏時間，研究結果為馬蹄蓮花粉離體保存提供了科學依據。

關鍵詞：馬蹄蓮;花粉活力鑒定;染色法;培養法;低溫貯藏中圖分類號：S682.2??????文獻標識碼：A

Identification of Pollen Vitality and?Factors Influencing?Storage Quality of Zantedeschia?spp.

LI Ziwei， GUO Yanbing， ZHANG Qi， WU Hongzhi^*

College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： The pollen of different varieties ofZantedeschia spp.?was selected as the experimental material to determine the optimal method to detect pollen viability and factors which influence pollen storage quality. The effects of TTC， Lugols solution， methylene blue and acetic acid magenta to detect pollen vitality were compared. The influence of pollen drying time （mean water content）， storage temperature， pre-cooling method and thawing method on pollen storage was explored. The results showed that the TTC method could?dye the pollen ofZantedeschiainto deep red， light red， and pink. However， the?Lugols solution?method?and ammonium acetate method could?not dye the pollen， and methylene blue could?dye all pollen blue. So only TTC method was suitable to?identifyZantedeschiapollen vitality. The most suitable culture medium for pollen germination was consisted of 80?g/L?sucrose， 0.2?g/L?boric acid， 0.3?g/L?calcium nitrate， and the best detection time for pollen vitality was 24 h cultured in the?medium. The treatment of drying pollen for 27 h， then putting into the refrigerator directly， combined?with water bath at 37?℃?for 2 min could?work with low temperature to maintain the vitality of the pollen well. Temperature had great impact on the vitality ofZantedeschiapollen stored. Among the experimental temperature， -80?℃?was the best one and still maintained more than 40% viability after storage for 61 days， then -20?℃?was second， room temperature was the third， and 4?℃?was the worst. Taken?together， TTC staining and culturedin vitromedia were the?suitable methods for identifying the vitality ofZantedeschiapollen. Low temperature -80?℃?could?prolong the storage time ofZantedeschiapollen significantly. The results would provide a scientific basis for preservingZantedeschiapollen.

Keywords： Zantedeschiaspp.; identification of pollen vitality;?dyeing method;?culture method;?low temperature storage

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.007

馬蹄蓮（Zantedeschiaspp.）為天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia Spreng.）的多年生草本球根花卉。由于其形態高雅、色彩艷麗，不僅可用作切花和盆花，還可扎成花束、花籃，還是春秋兩季花壇或花境的重要素材^[1]，因而其市場需求逐年增大。目前雜交育種是培育馬蹄蓮新品種的主要途徑，在雜交過程中，為解決親本花期不遇和異地授粉，需要對花粉進行貯藏和活力鑒定，因此，研究花粉活力檢測的適宜方法和花粉貯藏影響因子具有重要的理論和實踐意義。

低溫能延長花粉的貯藏期限^[2]，Mathad等^[3]研究表明，辣椒花粉在室溫下3?d就失去授粉能力，在-20?℃下可保存6 d，而液氮中保存48 d后仍能授粉結實。Kazushige等^[4]的研究發現，翠雀花粉室溫下貯藏期限不到21 d，在-30?℃下可以保存180 d;Alba等^[5]研究證明橄欖花粉在室溫下只能保存10 d，在液氮中的貯藏時間卻長達1年。Yuan等^[6]研究表明蝴蝶蘭花粉在室溫下只能保存28 d，4?℃下可以保存280 d，-80?℃下可以保存672 d，而且4?℃和-80?℃下貯藏后的花粉仍能授粉結實。目前，有關馬蹄蓮花粉的研究較少，主要是簡單的活力檢測^[7]，關于低溫或超低溫貯藏期限還未見報道。因此，本文研究馬蹄蓮花粉活力鑒定方法及貯藏特性，旨在為馬蹄蓮雜交育種中花粉活力檢測及離體保存提供理論依據，以促進這一優良種質資源的研究和利用。

1??材料與方法

1.1材料

供試用的彩花馬蹄蓮品種（ym002、ym005、ym011、ym032、ym035、ym037、ym044、ym064、ym088）的開花植株來自于云南昆明亞歐園藝有限公司塑料大棚內栽培的盆栽馬蹄蓮;白花馬蹄蓮則來自于云南農業大學園林園藝學院種質資源圃。于2017年10月至2018年9月晴天的上午9：00用干燥毛筆采集盛開的馬蹄蓮花粉，裝于墊有硫酸紙的培養皿中，迅速帶回實驗室備用。

本實驗先以白花馬蹄蓮花粉為材料，篩選出適宜馬蹄蓮花粉活力鑒定的染色法和萌發法、初步探索出馬蹄蓮花粉貯藏影響因子，隨后根據此結果以10個品種的馬蹄蓮花粉為材料，研究馬蹄蓮花粉的貯藏期限。

1.2方法

1.2.1 ?花粉染色法 ?氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride， TTC）染色法^[8]：在載玻片上加1～2滴0.5%TTC染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮新鮮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養箱中，12?h后置于顯微鏡下觀察。碘-碘化鉀（Lugols染色液）染色法^[9]：在載玻片上加1～2滴Lugols染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮新鮮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養箱中，5～10 min后置于顯微鏡下觀察。亞甲基藍染色法^[10]：在載玻片上加1～2滴0.025%亞甲基藍染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮新鮮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養箱中，5～10 min后置于顯微鏡下觀察。醋酸洋紅染色法^[11]：在載玻片上加1～2滴醋酸洋紅染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養箱中，10～ 15?min后置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 ?花粉離體培養 ?花粉離體培養采用固體培養基，設置不同種類培養基來篩選最適培養基。本研究采用正交試驗設計，用L₉（3⁴）正交表安排試驗，即3因素3水平試驗（表1）。配制母液：稱取MgSO₄·7H₂O?2?g，KNO₃ 1?g，赤霉素50?mg，定容至500 mL。除蔗糖、硼酸和硝酸鈣之外，每種培養基加50 mL母液和6 g瓊脂。培養基配置好后分裝在培養皿中，放入4?℃冰箱備用。

參照周滌等^[7]的方法，將白花馬蹄蓮新鮮花粉均勻彈落于培養基上，放于28?℃培養箱中黑暗培養24 h后每隔2?h進行鏡檢，直至觀察到花粉萌發率不再增加。萌發率=視野內萌發花粉粒數/視野內總花粉粒數×100%，各處理重復3次，每次重復統計花粉數不少于100粒。

1.2.3 ?花粉貯藏??影響花粉貯藏效果的因素有很多，除了貯藏溫度外，花粉自身的含水量、貯藏前的預凍處理及貯藏后的解凍方式也會對花粉活力產生影響^[12]。為了篩選馬蹄蓮花粉的最佳干燥時間、預凍處理及解凍方式，本研究采用正交試驗設計，用L₉（3⁴）正交表安排試驗，即三因素三水平試驗（表2）。采集新鮮的白花馬蹄蓮花粉作為材料，在室溫（18～25?℃）下干燥不同時長后，以不同的預凍方法處理后放入-80?℃冰箱貯藏，72?h后用不同的解凍方式處理后測定花粉活力。

根據篩選的最適的預凍和解凍方式，將10個馬蹄蓮品種的新鮮花粉置于室溫下干燥后，分裝至2 mL離心管中，做好標記，設置不同的貯藏溫度：室溫、4、-20、-80?℃?；ǚ刍盍y定：室溫和4?℃下貯藏的花粉每隔1?d測定1次活力，-20和-80?℃下貯藏的花粉每隔10 d測定1次活力。

1.2.4 ?顯微觀察 ?花粉染色和萌發觀察采用LEICA顯微鏡（ICC50 W， 德國）。使用LASEZ Version 3.2.1軟件進行圖像捕捉和保存。

1.3數據處理

采用Excel?10.0軟件處理數據和繪圖，并利用SPSS 18.0和正交設計助手軟件進行方差分析。

2 ?結果與分析

2.1不同染色法測定馬蹄蓮花粉活力的效果

TTC染色的原理在于檢驗花粉呼吸過程中脫氫酶的活性。具有活力的花粉呼吸作用較強，由于呼吸作用產生的氫能使無色的TTC還原成紅色的TTF，因此花粉被染成紅色;而無生命的花粉沒有呼吸代謝活力，TTC不被還原，因而不著色。實驗結果顯示，TTC將馬蹄蓮花粉染成不同程度的紅色（深紅、淺紅和粉紅），只是顏色分界不明顯，如圖1A所示。

Lugols染色液法是利用碘遇淀粉變藍的原理來檢測花粉活力。有活力的花粉積累的淀粉多，遇到碘化鉀溶液可以被染成藍色;無活力的花粉積累的淀粉少，因而不著色。實驗結果顯示馬蹄蓮花粉均未染成藍色而呈黃褐色，可能是因為馬蹄蓮花粉內淀粉含量較少，不足以與碘化鉀反應變色，如圖1B所示。

亞甲基藍是根據花粉胞質的有無來判斷花粉活力，一般有活力的花粉胞質豐富，花粉能被染成藍色;發育不完全沒有活力的花粉缺少胞質，花粉不著色。實驗結果顯示，馬蹄蓮花粉均被染成藍色，未成熟和敗育花粉也著色，可能是因為馬蹄蓮花粉內存在其他可以使亞甲基藍呈現藍色的物質，如圖1C所示。

醋酸洋紅染色法是根據花粉對醋酸洋紅的吸附作用來判斷花粉活力。有活力的花粉細胞內物質積累較多，對醋酸洋紅的吸附作用強，通常易被染成深紅色，沒有活力的花粉內含物少，因而不著色。實驗結果顯示馬蹄蓮花粉均未被染成深紅色而呈染色液本身的顏色，可能是因為馬蹄蓮花粉細胞壁過厚，醋酸洋紅染色液不能進入花粉細胞從而不著色，如圖1D所示。

綜上，Lugols 染色液和醋酸洋紅染色液均沒有使花粉染上對應的顏色;亞甲基藍染色液將檢測的所有花粉染成藍色，而TTC染色液將花粉染成不同程度的紅色，進而區分花粉活力強弱。所以除TTC染色法外，Lugols染色液、醋酸洋紅和亞甲基藍染色法均不適合馬蹄蓮花粉活力的鑒定。

2.2離體培養法鑒定馬蹄蓮花粉活力的適宜培養基

花粉萌發結果顯示（表3），不同培養基下的白花馬蹄蓮花粉萌發率相差很大，其中組合5培養基80 g/L蔗糖+0.2 g/L硼酸+0.3 g/L硝酸鈣培養24 h的效果最好，白花馬蹄蓮花粉在培養24 h的萌發率為76.64%，其次是組合4的69.75%，組合1最弱，只有36.78%。

通過K₁、K₂、K₃的大小可以判斷各因素對花粉萌發率的影響程度。以花粉平均萌發率為試驗指標，根據極差值R的大小，可以判斷各因素對花粉萌發率的影響主次，由表3中的結果可見，極差值R由大到小依次為A>C>B，所以主次因素的影響順序為A（蔗糖）>C（鈣）>B（硼酸）。

為判斷各因素對馬蹄蓮花粉萌發率的影響是否顯著，采用方差分析進行檢驗，精確評估各因素對花粉萌發率的影響程度。當F值>F_0.05時，表明相對應的因素達到顯著水平（P<0.05）。當F值>F_0.01時，表明相對應的因素達到極顯著水平（P<0.01）。由表4可知，各因素對花粉萌發率的影響順序為A（蔗糖）>C（鈣）>B（硼酸），且F_A值>F_0.05，表明蔗糖濃度對花粉的萌發率影響較顯著（P<0.05），而因素B（硼酸）和因素C（鈣）對花粉萌發率的影響不顯著。因此試驗最佳培養基組合為A₂B₃C₃，即80 g/L蔗糖+0.3?g/L硼酸+?0.3?g/L硝酸鈣。

2.3不同品種馬蹄蓮花粉的活力差異

由圖2可見，10個馬蹄蓮品種新鮮花粉在最佳組合培養基（80?g/L蔗糖+0.3?g/L硼酸+0.3 g/L硝酸鈣）中培養24 h的萌發率從高到低依次為白花馬蹄蓮>ym064>ym035>ym088>ym044> ym037> ym011>ym005>ym032>ym002。白花馬蹄蓮活力顯著（P<0.05）高于彩花馬蹄蓮;彩花馬蹄蓮中ym064顯著（P<0.05）高于其他品種，ym035與ym088、ym037與ym044、ym002和ym005與ym032之間花粉活力差異不顯著（P≥0.05）。

2.4花粉貯藏影響因子

2.4.1 ?花粉含水量、預凍方法及解凍方式對花粉貯藏活力的影響??以白花馬蹄蓮新鮮花粉作為材料，在室溫下干燥不同時間后，以不同的預凍方法處理后放入-80?℃冰箱貯藏72 h后，用不同的解凍方式處理，花粉活力測定結果表明（表5），不同處理方式對馬蹄蓮花粉的活力影響較大，其中組合⑦以室溫干燥27 h后直接放入-80?℃冰箱中貯藏，用37?℃水浴2 min解凍處理的萌發率最高，達到57.31%，其次是組合⑧的37.55%，組合⑤最弱，只有16.65%。

由表5極差分析可知，各因素對花粉萌發率影響的大小順序為：A?（干燥時間）>C?（解凍方法）>B?（預凍方法）。方差分析結果表明（表6），各因素的F值均小于F_0.05，干燥時間、預凍方法和解凍方法對花粉的萌發率影響均不顯著。

2.4.2??不同貯藏溫度對馬蹄蓮花粉活力的影響??由圖3A可知，白花馬蹄蓮新鮮花粉的活力最好，萌發率超過70%，室溫下貯藏10 d后仍有20%的萌發率。彩花馬蹄蓮ym064、ym035、ym088、

ym037和ym044新鮮花粉的活力較好，萌發率超過40%，室溫下貯藏10 d后除ym037萌發率降至6%外，其他品種花粉仍有15%的萌發率。而彩花馬蹄蓮ym011、ym032、ym005和ym002新鮮花粉的活力較弱，萌發率不到30%，室溫下貯藏10 d后萌發率只有6%，幾乎失活。

從圖3可以看出，4?℃貯藏10?d后，除白花馬蹄蓮與彩花馬蹄蓮ym064仍有20%以上的萌發率（圖3B），其余品種花粉的萌發率均不到15%。-20?℃下貯藏31?d后，彩花馬蹄蓮ym002、ym005、ym032、ym037和ym011萌發率已降至10%，將近失活;貯藏51 d后，除ym064仍有15%的萌發率外，其余品種的花粉萌發率均不到10%，61 d后所有品種花粉萌發率只有5%（圖3C）。-80?℃下貯藏61 d后，白花馬蹄蓮花粉仍有40.68%的萌發率，彩花馬蹄蓮ym064、ym035、ym044、ym037和ym088仍有20%的萌發率。彩花馬蹄蓮ym011、ym032、ym005和ym002的花粉在貯藏前萌發率較低，但其貯藏后的萌發率仍然超過10%（圖3D）。

此外，在相同貯藏條件下，不同馬蹄蓮花粉活力的變化明顯不同，其中白花馬蹄蓮的花粉活力最強，下降最慢;彩花馬蹄蓮ym005的花粉活力最弱，下降最快，同種花粉在不同貯藏條件下的活力也有顯著差異，說明花粉活力與貯藏溫度和花粉來源密切相關。

從圖4可見，馬蹄蓮花粉在室溫、4?℃、-20?℃和-80?℃下貯藏10 d后，-80?℃下貯藏的花粉平

-80?℃下貯藏的10個馬蹄蓮花粉，貯藏31?d時，其平均萌發率從44.39%下降到28.86%;貯藏61?d時，平均萌發率仍有22.77%。與-80?℃貯藏相比，-20?℃貯藏的馬蹄蓮花粉，其活力下降較快，51?d后花粉萌發率不到10%，61 d后花粉萌發率力只有3.61%。而室溫和4?℃貯藏的馬蹄蓮花粉，其萌發率在2 d前相差不大，4 d后4?℃的貯藏效果明顯低于室溫。

3 ?討論

本研究所采用的4種染色法中，除TTC染色法外的3種染色法均不適于馬蹄蓮花粉活力的測定，Lugols染色液及醋酸洋紅染色液均未能使馬蹄蓮花粉著色，可能是由于馬蹄蓮花粉的花粉壁對這2種溶液有限制作用，染色液不能穿過花粉壁進入原生質體，從而不能使花粉著色^[13]，也可能是馬蹄蓮花粉所含的淀粉較少，不能使Lugols染色液染色液變色;在亞甲基藍溶液作用下馬蹄蓮花粉均被染成藍色，說明沒有活力的花粉也有足夠的胞質被亞甲基藍染色，所以此方法不能區分馬蹄蓮未成熟和敗育花粉;本研究中TTC染色時間過長，如若大幅縮短染色時間，有可能會更好地分辨強活力、弱活力和無活力的花粉。染色法測定花粉活力雖然比實際值偏高，但快速便捷，在實際應用中建議先用TTC染色法對馬蹄蓮花粉活力做定性分析，再用萌發法對花粉做定量分析。

花粉長期冷凍貯藏時，其含水量與活力關系密切。含水量過高，花粉易受凍死亡喪失活力;含水量過低，花粉的代謝受到抑制則影響活力^[14]。因此，花粉只有在適宜的含水量下貯藏才會持久的保持其活力^[15]。芍藥花粉超低溫保存效果最好的含水量為12%左右^[16];山茶花粉超低溫保存效果最好的含水量為15%～23%^[17];枇杷花粉超低溫保存效果最好的含水量為30%左右^[18];部分梅花在含水量高達40%時仍然可以進行超低溫保存^[19]。本研究用不同干燥時間區分花粉含水量，并發現馬蹄蓮花粉干燥27 h后在低溫貯藏環境中仍能保持較高的活力。有研究發現，干燥溫度越低，花粉的失水速度越慢，細胞自由水含量也較高，花粉在低溫貯藏過程中更易形成細胞內結晶，引起細胞破裂，導致花粉活力降低^[20-21]。本研究在室內（室溫18～25?℃）干燥花粉，室內空氣濕度差異也可能對花粉的失水程度產生影響，因此，后續研究有必要將空氣濕度考慮在內。

預凍處理對花粉活力的影響因品種而異。桃、梨花粉和人參花粉的超低溫貯藏效果不受預凍處理的影響^[22-23];山茶和番茄花粉的超低溫貯藏效果因預凍處理而顯著提高^{[17， 24]};芍藥和臘梅花粉的超低溫貯藏效果則因預凍處理而顯著降低^{[16， 25]}。本研究中馬蹄蓮花粉的貯藏效果不受預凍處理的影響，與桃、梨和人參花粉的研究結果相一致^[22-23]。

解凍過程是維持馬蹄蓮貯藏活力關鍵的一步，芍藥和番茄花粉超低溫保存后自來水沖洗的解凍方法效果較好^{[16， 24]}，而地被菊和山茶花粉超低溫保存后溫水浴和冰化的解凍方法效果較好^{[12， 17]}。本研究中馬蹄蓮花粉低溫貯藏后采用何種解凍方法對其萌發率的影響都不顯著。

低溫可以抑制花粉代謝活性進而延長花粉的貯藏期限。王欽麗等^[2]研究表明，在超低溫度（-270～-180?℃）下花粉的生活力可以長期維持。一般來說，耐寒植物花粉萌發的適溫較低，而喜溫植物花粉萌發適溫較高。馬蹄蓮喜溫暖濕潤和陽光充足的環境，不耐寒也不耐旱，其生長開花均需要相對高的溫度。本研究中，室溫下馬蹄蓮花粉的貯藏效果要稍好于4?℃低溫，說明馬蹄蓮花粉在常溫條件下耐貯性較好，這與馬蹄蓮適宜的生長溫度一致，此結果也與周滌等^[7]的研究結果相一致;-20?℃下花粉的貯藏效果則優于室溫;-80?℃下花粉貯藏61?d后仍有活力，貯藏效果顯著高于其他3種溫度，與山茶和百合花粉的研究結果相一致^{[17， 21]}。

本研究從干燥時間、預凍處理、解凍方式和溫度4個主要因素測定了馬蹄蓮花粉低溫貯藏的效果，探明這些因子對馬蹄蓮低溫貯藏的影響，至于馬蹄蓮花粉貯藏的低溫極限，在超低溫保存中是否會出現迎春、紫葉桃等花粉超低溫保存的“冷刺激”現象^[15]有待進一步研究。

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