高效液相色譜法測定蛹蟲草中噴司他丁的含量

張春楊，楊思廣，張月，錢琨，周影，李冰

1. 吉林省蠶業科學研究院，吉林 吉林 132000；2. 吉林市食品藥品檢驗所，吉林 吉林 132011；3. 德惠市園藝特產工作室，吉林 長春 130300

噴司他丁是一種抗腫瘤藥物，多由目前已有文獻從基因角度證實蛹蟲草可以合成噴司他丁，其濃度水平與蛹蟲草的品質和毒性有關。本研究對蛹蟲草中噴司他丁含量檢測的提取溶劑、提取時間、提取方法等參數進行單因素考察，并通過雙因素完全試驗確定了蛹蟲草中噴司他丁含量測定的提取條件并將提取物經質譜鑒定確認。參照噴司他丁的高效液相色譜條件，檢測了7種不同來源的鮮蛹蟲草經烘干和凍干不同加工工藝后，噴司他丁的含量差異。發現凍干組處理后的蛹蟲草中噴司他丁為烘干組的3-5倍。在檢測中發現蛹蟲草中的噴司他丁會隨時間而分解，這也解釋了前期預研實驗中購買的干蛹蟲草中很難檢測到噴司他丁的原因。

蛹蟲草Cordyceps militaris又名北冬蟲夏草，由于其功效成分與冬蟲夏草類似，與冬蟲夏草相比又有較大的價格優勢，目前在市場中的銷售份額逐年攀升。中科院上海植物生理生態研究所王成樹研究發現[1,2]，研究了蛹蟲草中噴司他丁的含量檢測方法。并比較了我單位生產的7種不同來源的鮮蛹蟲草經烘干和凍干不同加工工藝后，噴司他丁的含量差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HERMLE Z36HK高速冷凍離心機；Thermo Fisher Scientific U-3000高效液相色譜儀（配DAD檢測器）；Waters e2695-2998高效液相色譜儀（配DAD檢測器）；HSC-24B水浴氮吹儀；JCX-600Z超聲波清洗機；Waters H-CLASS/XEVO TQD液相色譜/三重四級桿串聯質譜儀；Sartorius BSA224S-CW電子天平；IKA VORTEX3漩渦混合器。

1.2 試藥 噴司他丁對照品（美國TargetMol）；乙酸銨：分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇：分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇：質譜級（德國默克）；乙腈：質譜級（德國默克）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：CHROM水相C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動相：2.5 g/L乙酸銨溶液-甲醇-乙腈（96:2:2）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：282 nm；進樣量10 μL。在此條件下，噴司他丁與其他色譜峰分離良好。

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 標準曲線的制備 精密稱取噴司他丁對照品10 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為200 μg/mL的標準貯備液。再用水稀釋標準貯備液，得到濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的噴司他丁系列標準工作溶液。

2.2.2 試樣溶液的制備 稱取樣品0.5 g，加水25 mL，超聲處理10 min，加水補足減失的重量，取上清液，過0.45 μm濾膜，待測。

2.3 測定條件的選擇 取適量的噴司他丁標準品溶液，在200-400 nm范圍內進行紫外全波長掃描。噴司他丁在213 nm和282 nm處有最大吸收。考慮到在低波長下通常會有較多的雜質信號干擾，故最終選擇282 nm作為檢測波長。

3 討論

3.1 柱溫的選擇 分別在柱溫30 ℃和35 ℃條件下進行測定，因考慮實驗效率問題，未建立凈化方法，樣品溶液中存在部分水溶性雜質，升高柱溫使得各組分保留時間提前，導致噴司他丁分離度降低，故而確定柱溫為25 ℃。

3.2 蛹蟲草炮制工藝的改進方向 本次試驗樣品由吉林省蠶業研究院提供，院內采用高溫烘干的方式對蛹蟲草進行干燥處理。因噴司他丁熱穩定性差，受熱極易分解，在試驗中發現新制成品中噴司他丁含量低，且分解后雜質較多，真空包裝放置3個月后，噴司他丁含量基本降為0。蛹蟲草有抗癌功效，其相關功效成分即為噴司他丁，由此可見，干燥工藝對蛹蟲草功效起著至關重要的作用。本實驗室后期采用凍干工藝，對小批量蛹蟲草進行干燥處理，成品中噴司他丁含量與原工藝相比提高了3-5倍，極大改善了因噴司他丁受熱分解而導致蛹蟲草功效下降的情況。后續將從成本與經濟效益方面，對蛹蟲草的干燥工藝進行更深入的研究。