嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB轉糖苷催化活性改造

董藝凝，陳衛，陳海琴*，趙建新，陳永泉，張灝

1(滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州，239000)2(江南大學 食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)全稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactosidegalacto hydrolase, EC.3.2.1.23)，具有水解和轉糖苷兩種催化功能[1-2]。工業上以乳糖為底物，利用β-半乳糖苷酶的轉糖苷催化活性合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides, GOS)，這種功能性低聚糖能夠調控腸道益生菌生長[3]。根據氨基酸序列相似性分類，β-半乳糖苷酶分屬于糖苷水解酶GH1，GH2，GH35，GH42，GH50和GH59家族[4-5]。其中，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)來源β-半乳糖苷酶BgaB屬于GH42家族，是一種具有工業應用潛力的耐熱酶[6]。耐熱β-半乳糖苷酶可在相對高溫條件下保持穩定性及催化活性。高溫條件能夠提高濃度底物，降低水分作為受體的競爭性，進而提高轉糖苷與水解催化比率(transglycosylation-to-hydrolysis, T/H)。因此，耐熱β-半乳糖苷酶在高溫催化合成GOS工藝方面具有顯著技術優勢，并有望突破現有產量瓶頸[7-9]。但GH42家族原核微生物來源的β-半乳糖苷酶通常對乳糖催化活性較弱，并導致轉糖苷產物GOS合成量較低[10-12]。這也是GH42家族原核微生物來源耐熱β-半乳糖苷酶的共性問題。

目前，GH42家族已有9個晶體結構報道[13-15]。本研究前期以β-半乳糖苷酶晶體結構為模板，通過同源建模及定點突變的方法，對部分影響底物結合的氨基酸位點進行了功能探討[16-18]。現有研究顯示起到親核催化作用的氨基酸位置及類型，對酶的催化活性至關重要。如2013年SABURI等研究發現，親核催化氨基酸殘基(—COO-)被半胱氨酸(Cys)巰基(—SH)替換并氧化后，提高了葡聚糖酶(dexran glucosidase)轉糖苷活性[19]；2010年COCKBURN等采用類似方法對Cellulomonasfimi來源纖維素酶CenA兩個推測催化位點Asp392和Asp216進行半胱氨酸替換和化學修飾，優化了CenA的最適作用pH[20]。

基于上述研究發現，本文以GH42家族Geobacillusstearothermophilus來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB為研究對象，通過對催化氨基酸位點的改造與突變體催化特性分析，初步探討了催化氨基酸位點突變對β-半乳糖苷酶轉糖苷活性的影響。本研究為GH42家族β-半乳糖苷酶的功能改造及應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

Escherichiacoli(E.coli) JM109 (recA1，supE44，endA1，hsdR17，gyrA96，relA1，thi，Δ([lac-proAB] F’ [traD36，proAB+，lacIq，lacZ(M15])，DH5α (supE44 ΔlacU169hsdR17 (Φ80lacZΔM15)RecA1endA1gyrA96thi-1relA1)，質粒載體pKK223-3,均由江南大學食品生物技術中心菌種庫提供。

1.1.2 生化試劑

氨芐青霉素(Amp)，上海生工；限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶，Takara公司；KOD plus高保真DNA聚合酶，Toyobo公司；DpnI，Fermentas公司；DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；PCR產物純化試劑盒，北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京莊盟生物基因科技有限公司；鎳親和柱(Ni-Chelaing Column)，Qingen公司。

1.1.3 儀器與設備

GS00001PCR儀，G-STROM公司；5415R/5804R冷凍離心機，Eppendorff公司；Power pac核酸電泳儀，Basic 041BR蛋白質電泳儀，Geldoc 2000凝膠成像系統，Bio-Rad Laboratories公司；UV-2100可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；VCX500超聲波破碎儀，Sonics&Materials公司；Discovery Sdudio分子動力學模擬軟，BIOVIA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 同源建模

BgaB同源序列應用PSI-BLAST算法[21]，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)無冗余數據庫(non-redundant database)中檢索獲得。多重序列比對、BgaB同源分子結構模擬及底物對接采用Discovery Studio軟件完成。基于序列比對分析，選擇ThermusthermophilusA4來源的β-半乳糖苷酶(A4-β-Gal)晶體結構(PDB∶1KWK)，作為模板。

1.2.2 E303C定點突變體的構建[22]

以本實驗室已構建質粒pKK223-3-bgaB為模板，采用快速全質粒擴增突變法(QuickChange?ite-directed mutagenesis protocol)針對選擇位點構建Cys替換單點突變體，引物設計如表1所示。

1.2.3 野生型及突變體酶的表達與純化

挑選野生型與突變體重組菌單克隆接種于5 mL LBA(含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB)培養基中，37 ℃下振蕩培養過夜。按1%接種量將飽和種子液接種于200 mL LBA培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600達到0.6～1.0時，添加IPTG(終濃度達1 mmol/L)于20 ℃過夜誘導表達。收集菌體用100 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)重懸，超聲波破壁。粗酶液過鎳親和柱純化得純化酶蛋白樣品。

表1 定點突變引物核酸序列

1.2.4 突變體的氧化[23]

突變體酶采用KI進行氧化，以野生型酶作為對照，在相同的條件下進行氧化處理。為確定最優KI處理濃度，氧化反應體系設定為100 μL，含10 μmol/L Br，50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.5)，0～300 mmol/L KI，3 μmol/L 野生型及突變體酶。氧化體系經25 ℃處理30 h后測定酶活。

1.2.5 β-半乳糖苷酶比酶活測定

按Gist-Bracades法測定耐熱β-半乳糖苷酶酶活，并以BgaB最適作用條件設定反應溫度及pH[24]。取100 μL酶液和900 μL磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)加入10 mL試管中混勻，加5.0 mLoNPG 55 ℃精確反應10 min后，置于冰水浴中并加入2.0 mL Na2CO3溶液終止反應。室溫下用分光光度計(420 nm)以空白值為參比測定樣品吸光度。酶蛋白質含量采用BCA法測定，按公式(1)計算酶活：

(1)

式中：E420,420 nm處的吸光度值；Ew，0.1 mL所用酶液含酶的重量(g)；8,反應總體積；10,反應時間(min)；4.45,在實驗條件下1 μmoloNP/mL的吸光度值。

1.2.6 轉糖苷產物測定

在標準氧化反應條件下(pH 6.5，55 ℃，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液)，加入乳糖作為反應底物，反應30 h后，95 ℃加熱5 min終止反應，取反應混合物進行薄層色譜分析。

取反應液20 μL梯度稀釋后，進行高效液相色譜分析。其中乳糖、半乳糖和葡萄糖根據標準品定量，低聚半乳糖含量根據面積歸一化法計算。色譜柱為TSKgel Amide-80氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相，乙腈與水按體積比70∶30混合；色譜條件為流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量15 μL；蒸發光散射檢測器，漂移管溫度45 ℃；N2壓力3.0×105Pa。

2 結果與分析

2.1 催化氨基酸位點預測

以A4-β-gal(PDB：1KWK)為模板，采用同源建模方法構建了耐熱β-半乳糖苷酶BgaB分子結構。將所得β-半乳糖苷酶BgaB同源模擬結構在Discovery Sdudio軟件中進行半乳糖底物分子轉接。結果如圖1所示，參與底物結合的關鍵氨基酸位點包括Arg109、Glu148、Phe341、Trp311、Asn147、Asn310、Try272、Glu303和His354。其中，Glu148和Glu303參與底物成鍵數量比其他預測位點多，表明其對催化活性具有重要影響。序列比對結果顯示Glu303對應于A4-β-gal親核催化氨基酸Glu312。由此，推測Glu303為BgaB親核催化氨基酸位點。

圖1 β-半乳糖苷酶BgaB與半乳糖分子結合位點示意圖

2.2 E303位點突變體的表達純化與功能分析

本研究分別對E303位點構建了半胱氨酸(Cys)替換突變體E303C，以及丙氨酸(Ala)替換突變體E303A。Ala突變可以反映出某一氨基酸位點缺失對催化作用的影響[25]。將野生型及單點突變體酶重組表達及純化后，均得到70 kDa單一蛋白條帶，與野生型BgaB蛋白分子質量大小一致，表明突變體酶得到正確表達(圖2)。

M-markers； WT-野生型；1-E303A;2-E303C

野生型及突變體酶水解活性，試驗結果如表2所示。突變體酶E303A未檢測到水解活性；突變體酶E303C相對野生型水解活性大幅度下降，僅為野生型酶活性的0.6%。突變體酶E303A和E303C相對野生型酶活變化情況表明，E303位點替換為Ala和Cys后出現了失活和酶活大幅度損失兩種明顯改變。親核催化位點是β-半乳糖苷酶形成底物氫鍵結合網絡及保持型糖苷水解催化機制(retaining glycoside hydrolases)的關鍵[26-28]。突變體酶E303A失活可能就是由于E303位點羧基(-COOH)側鏈突變為丙氨酸的氫基側鏈(-H)后，原有極性側鏈功能缺失所致；而突變體酶E303C殘留有少量酶活，可能是由于巰基側鏈(-SH)與羧基側鏈(-COOH)同為極性側鏈，也能通過氫鍵結合底物從而維持部分水解催化機能。E303位點被兩種不同極性氨基酸替換，均產生劇烈的酶活改變，這一實驗現象符合催化氨基酸位點功能特征。由此，推斷E303為BgaB的親核催化氨基酸位點。

表2 野生型及突變體酶以oNPG為底物的比酶活

注：“-”表示未測出。

2.3 E303C突變體巰基側鏈氧化

以野生型酶為對照，氧化劑(KI)濃度對野生型及突變體酶水解活性影響如圖3-a所示。Ox-E303C突變體酶活隨KI濃度的增大而增加；當KI濃度達到200 mmol/L后，酶活保持穩定，表明巰基側鏈氧化完成。而野生型酶在0～300 mmol/L KI濃度處理范圍內，酶活沒有明顯變化；當KI濃度增大到200 mmol/L后，酶活降低至原來的65%。試驗結果表明200 mmol/L KI為最適氧化濃度。在最適KI濃度條件下，處理時間對突變體酶及野生型酶活影響如圖3-b所示。Ox-E303C酶活在192 h達到最大，并保持穩定。試驗結果表明經200 mmol/L KI氧化處理192 h可以獲得穩定Ox-E303C突變體酶。

a-KI濃度對酶活的影響；b-處理時間對酶活的影響

2.4 Ox-E303C突變體轉糖苷催化活性鑒定

β-半乳糖苷酶可將乳糖分解為半乳糖、葡萄糖，并將單糖轉接到半乳糖分子上，形成乳糖以及聚合度大于2的系列低聚半乳糖[29]。野生型及突變體酶Ox-E303C、E303C反應產物TLC結果如圖4所示。

與E303C突變體酶和野生型酶相比，突變體酶Ox-E303C除了含有乳糖、葡萄糖和半乳糖外，產物組分中還多了低聚半乳糖顯色斑；同時，突變體酶E303C較野生型酶多了乳糖色斑，可能是由于其水解活性弱，相同反應條件下乳糖水解不完全所致。TLC分析結果初步表明，Ox-E303C突變體具有轉糖苷催化能力；而野生型酶和突變體酶E303C沒有轉糖苷產物檢出，表明轉糖苷催化活性缺失或過弱。

野生型酶、E303C和Ox-E303C突變體酶反應終產物的HPLC結果如圖5所示。野生型酶產物組分為半乳糖和葡萄糖(圖5-a)；E303C突變體水解活性相對野生型酶低，相同條件下底物乳糖水解不充分，產物組分中除了半乳糖和葡萄糖，還含有殘留底物乳糖峰(10.087 min)(圖5-b)。與野生型及E303C突變體酶相比，Ox-E303C反應產物在20.783 min出現了新組分峰，聚合度量大于單糖和乳糖，為GOS產物。在氨基柱色譜條件下GOS顯示為單峰(圖5-c)，其相對峰面積占產物組分總量的11.5%。這一結果表明Ox-E303C突變體酶相對野生型酶和E303C突變體酶生成了轉糖苷催化活性。結合TLC分析可知，其轉糖苷催化產物GOS由3～4個組分構成。相同試驗條件下，Ox-E303C可將野生型酶GOS合成量由0%提高到11.5%。

3 結論

本研究以GH42家族Geobacillusstearothermophilus來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB為研究對象，通過對氨基酸位點Glu303進行Ala替換及突變體活性分析，預測了該位點的親和催化氨基酸功能。采用定點突變與化學修飾相結合的方法對Glu303位點的改造與突變體性質分析結果表明，以—SOO-替換親和催化氨基酸側鏈，能夠提高耐熱β-半乳糖苷酶BgaB的轉糖苷催化能力。轉糖苷活性低是GH42家族β-半乳糖苷酶的共性問題，本研究針對BgaB催化氨基酸位點的改造與功能研究結果，對GH42家族β-半乳糖苷酶轉糖苷催化活性的改造及調控具有廣泛的參考價值。

M-markers；WT-野生型；1-E303C；2-OX-E303C