雙波長可見吸收光譜法測定糕點及碳酸飲料中的苯甲酸

江虹, 龐向東, 曾曉莎

(長江師范學院 化學化工學院，重慶， 408100)

苯甲酸和山梨酸作為常用食品添加劑，具有保持食品營養、防止食品腐敗變質，提高食品質量的作用。但當過量使用時，則具有一定的毒性，對食用者的健康會造成一定的危害。為此，世界各國對食品中某些添加劑的使用量和殘留量均作了嚴格規定。我國食品安全國家標準食品添加劑使用標準GB 2760—2014中，對各種食品中苯甲酸的最大使用量有嚴格規定。鑒于此，對食品中的防腐劑含量進行研究有著重要意義。近年，國內外對食品中苯甲酸的檢測方法主要有：高效液相色譜法[1-9],氣相色譜法[10-11], 電化學法[12-13]、氣-質聯用法[14-16]、液-質聯用法[17-21]和紫外分光光度法[22-24]等。高效液相色譜法、氣相色譜法、氣-質聯用、液-質聯用等方法的前處理較為麻煩，日常運行費用較高，電化學法條件要求較苛刻，已報道的紫外分光光度法線性范圍窄、靈敏度不高。因此，研究更為簡便、快速和靈敏的方法有著重要意義。本實驗發現，在一定的Tris-HCl 介質中，苯甲酸能與乙基紫反應(在可見光區產生較強的負吸收信號)，而食品中可能共存的山梨酸(sorbic acid，SBA)在相同條件下與乙基紫反應則基本無吸收。基于這一點，建立了不需分離山梨酸即可測定苯甲酸的雙波長可見吸收光譜法，方法用于糕點及碳酸飲料中苯甲酸的測定，結果滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸(benzoic acid，BZA)(≥99%)，成都化夏化學試劑有限公司；山梨酸(sorbic acid，SBA)：(99.8%)，上海邁瑞爾化學技術有限公司；乙基紫(ethyl violet，ETV)：(AR級)，上海邁瑞爾化學技術有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：(AR級)，山東西亞化學工業有限公司；HCl：(AR級)，重慶川東(化工)集團有限公司；樣品，市售碳酸飲料(簡寫為1 # 和2#)、蛋糕(簡寫為3#)和面包(簡寫為4#)。

BZA 標準溶液：準確稱取適量純度≥99% 的BZA(精確至±0.000 1 g)，用少許無水乙醇溶解后，用水定容，配成1.00×10-3mol/L貯備液，操作液為1.00×10-4mol/L。SBA 標準溶液：準確稱取純度為99.8% 的SBA 適量(精確至±0.000 1 g)，用少許無水乙醇溶解，用水定容，配成1.00×10-3mol/L貯備液，操作液為1.00×10-4mol/L；ETV 溶液：1.00×10-3mol/L；Tris 溶液：0.20 mol/L；HCl 溶液：0.10 mol/L。Tris-HCl 溶液：pH 3.0～9.8(用pH 計測定)。

1.2 儀器與設備

U-3010型紫外-可見分光光度計，日本日立公司；EL104型電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；pHS-3C 精密酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司；TD5A-WS 型離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；KQ-200VDE 超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 樣品處理

準確移取1# 和2# 碳酸飲料10 mL 于小燒杯中，40 ℃水浴超聲20～30 min，除去CO2后冷至室溫，用水定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即為碳酸飲料待測液。

準確稱取已粉碎混勻的糕點樣品3# 和4# 各2～3 g(精確至±0.000 1 g)于50 mL 燒杯中，加適量水，40℃ 超聲提取20～30 min 后，移入離心管中，以4 000 r/min 離心分離10 min，清液轉入100 mL 容量瓶中，用水定容。

1.4 實驗方法

準確移取pH 8.54 Tris-HCl 溶液1.00 mL、ETV 溶液2.00 mL于10 mL 比色管中，搖勻后加入0～1.00 mL 1.00×10-4mol/L BZA 標準操作溶液，搖勻，用水定容至刻度。靜置10 min 后，以試劑空白作參比，掃描吸收光譜，在497 nm 和628 nm 處，用雙波長法測定溶液的吸光強度A。

2 結果與分析

2.1 BZA及SBA與ETV的吸收光譜特征比較

圖1和表1是苯甲酸體系的吸收光譜特征及可能共存物山梨酸體系的吸收光譜特征比較。由圖1和表1可知，單獨的BZA 和SBA 在可見光區幾乎無吸收，在紫外區有較強吸收(曲線1 和2)。ETV 的弱堿性溶液有強吸收(曲線3)，最大吸收波長位于594 nm。在ETV 的弱堿性(pH 8.54)溶液中加入SBA 溶液后，SBA 體系溶液在可見光區幾乎無吸收，在紫外區有較強吸收(曲線4)。當在與SBA 體系相同條件的ETV 弱堿性溶液中加入與SBA 同濃度的BZA 溶液后，ETV 體系溶液在可見光區產生2 個較強的負吸收峰，最大負吸收峰位于497 nm(藍移97 nm)；次大負吸收峰位于628 nm，(紅移34 nm)(曲線5)，并使溶液發生褪色現象。由圖2可知，BZA 體系在497 nm 和628 nm 處，BZA 的濃度與吸光度的絕對值(│A│)有線性關系，并服從朗伯-比爾定律。由上可見，在pH 8.54 的Tris-HCl 介質中，山梨酸-乙基紫體系在可見光區幾乎無吸收，而同條件下的苯甲酸-乙基紫體系在可見光區不僅有較強的負吸收，而且遵從朗伯-比爾定律，可用于苯甲酸的定量分析。故當山梨酸與苯甲酸共存時，可以不經分離直接測定苯甲酸。為了提高方法的靈敏度，本工作采用497 nm 和628 nm 處的雙波長(DWO-VIS)法(吸光度具有加和性)來定量測定苯甲酸，其靈敏度約為單波長法的2倍。

1-1.00×10-5 mol/L 山梨酸, 水作參比; 2-1.00×10-5 mol/L苯甲酸, 水作參比; 3-2.00×10-5 mol/L 乙基紫, 水作參比;4-1.00×10-5 mol/L 山梨酸-2.00×10-4 mol/L 乙基紫,試劑空白作參比;5-1.00×10-5 mol/L 苯甲酸 - 2.00×10-4 mol/L乙基紫, 試劑空白作參比; pH 8.54

1～5-0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 1.00×10-5 mol/L苯甲酸-2.00×10-4 mol/L 乙基紫, 試劑空白作參比; pH 8.54

2.2 反應的適宜條件

2.2.1 溶液pH 的選擇

考察了BZA-ETV體系及可能共存物SBA-ETV體系在其他條件相同的情況下，不同pH的Tris-HCl溶液對各體系吸光度絕對值(│A│)的影響(497 nm和628 nm處)，見圖3。由圖3可知，BZA-ETV體系受酸度影響較大，當方法的靈敏度相對最大時，在497 nm和628 nm處的最佳酸度為pH 8.54，此條件下BZA與ETV能反應完全。當pH大于或小于8.54時，由于體系堿性偏大或酸性偏強(未達理想酸度)均不能使BZA與ETV間的反應完全(即只能部分反應)，因而│A│有所降低。而SBA-ETV體系在堿性范圍內，│A│(很低)基本不受酸度的影響，而在酸性條件下對│A│有一定影響。酸度對BZA體系與SBA體系所產生的不同影響，是由于BZA與SBA結構差異所致。由此可見，只要控制好溶液的酸度(控制在堿性范圍內)，即可實現不分離山梨酸(可能的共存物)便可直接測定苯甲酸的目的。為了提高方法的靈敏度，采用DWO-VIS法定量測定苯甲酸。

圖3 pH對│A│的影響

表1 苯甲酸-乙基紫體系與山梨酸-乙基紫體系吸收光譜特征

注：—表示基本無吸收。

2.2.2 pH 8.54 Tris-HCl 溶液用量的選擇

考察了室溫下497 nm 和628 nm 處，pH 8.54 Tris-HCl 溶液的用量對BZA-ETV 體系│A│ 的影響，見圖4。由圖4可知，pH 8.54 Tris-HCl 溶液用量為1.00 mL 時，體系│A│ 相對最大，即靈敏度最高。當pH 8.54 Tris-HCl 溶液用量大于或小于1.00 mL 時，因用量過多或過少(即條件不合適)而使反應不發生或部分發生，從而使│A│ 降低；故實驗用1.00 mL pH 8.54 Tris-HCl 溶液。

2.2.3 ETV溶液濃度的選擇

考察了室溫下497 nm和628 nm處，ETV溶液濃度(取ETV溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL)對BZA-ETV 體系│A│的影響，見圖5。由圖5可知，靈敏度最大時，ETV溶液的濃度為2.00×10-4mol/L。當ETV 溶液濃度小于2.00×10-4mol/L時，因ETV用量不夠使反應不能完全，從而導致│A│有所降低；當ETV溶液濃度大于2.00×10-4mol/L 時，因ETV用量過多使自身聚集作用增強，從而使BZA 和ETV 的反應不能完全，導致│A│降低。故實驗取1.00×10-3mol/L乙基紫溶液2.00 mL。

圖4 pH 8.54 Tris-HCl 用量對│A│的影響

圖5 乙基紫溶液濃度對│A│的影響

2.2.4 試劑加入順序的選擇

考察了室溫下497 nm 和628 nm 處，1.00 mL BZA標準溶液、2.00 mL ETV 溶液及1.00 mL pH 8.54 Tris-HCl 溶液為不同加入順序時對BZA-ETV 體系│A│ 的影響。結果表明，試劑加入的先后順序對BZA 與ETV 的反應完全程度有一定影響。當靈敏度相對最大時的加入順序是：Tris-HCl 溶液、ETV 溶液、BZA 溶液(A497=-0.498，A628=-0.368)。故實驗按最佳順序進行。

2.2.5 反應時間及穩定性

考察了室溫下497 nm 和628 nm 處，BZA 與ETV 反應時間對體系│A│ 的影響。結果表明，該反應在10 min內可進行完全，10 min時，A497=-0.504，A628=-0.370；10～100 min，│A│ 基本處于平穩狀態；100 min后，│A│有下降趨勢。故實驗選在10 min后的平穩區進行測定。

2.3 工作曲線及相關參數

依照前面各項選定的最佳條件，取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 1.00×10-4mol/L BZA 標準操作液，配制標準系列溶液，并用DWO-VIS 法測定各溶液的吸光度，作A497+628-ρ標準曲線，見圖6，相關參數見表2。可知，用雙波長法測定的靈敏度約是單波長法測定的2倍，即雙波長法能有效提高方法的靈敏度。后續實驗均用雙波長法進行測定。

圖6 苯甲酸的標準曲線

表2 標準曲線相關參數

2.4 共存物質的影響

2.5 樣品分析

取1.3 節已處理的1# 待測液2.00 mL、2#～4# 待測液各3.00 mL 分別代替1.4 節中的苯甲酸標準溶液，再按1.4 節方法加入其他試劑溶液并定容至10 mL。借助標準曲線或回歸方程，用雙波長法測定待測樣液及原始飲料及糕點中的苯甲酸含量。各樣液平行測定5份。結果見表3。

為了判斷新方法的準確度，續做加標回收試驗。準確移取各原始碳酸飲料10 mL 或準確稱取糕點樣品2～3 g(精確至±0.000 1 g)，加入高、中、低 3 水平的苯甲酸標準溶液后，按1.3 節的方法處理樣品，再用水定容于100 mL 容量瓶中，各水平平行配制5 份。測定結果見表3。表中數據表明，本法有較高的準確度和精密度。

表3 碳酸飲料及糕點樣品分析結果及回收試驗(n=5)

注：ND 為未檢出；樣品含量<檢出限的按檢出限的1/2 計算回收率。

3 結論

以乙基紫作顯色劑，在可見光區測定苯甲酸的雙波長吸收光譜法，操作簡便、快速，有較高的準確度、精密度及靈敏度，也有良好的選擇性及較寬的線性范圍(較文獻[23-24]的線性范圍寬)。樣品前處理簡單，測定過程中，樣液不需分離，可直接測定樣品中的苯甲酸。本方法適于糕點及飲料中苯甲酸的快速測定。