高效液相色譜法測(cè)定魚露中章魚胺和牛磺酸

陳麗麗，白春清，袁美蘭，江勇，趙利*

1(江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330013)2(國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，江西 南昌，330013)

眾所周知，生物源單胺章魚胺(octpamine，OA)在各種無脊椎動(dòng)物中扮演著神經(jīng)激素、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和神經(jīng)遞質(zhì)的角色，在多數(shù)無脊椎動(dòng)物的神經(jīng)和非神經(jīng)組織中都發(fā)現(xiàn)了它，其功能相當(dāng)于脊椎動(dòng)物交感神經(jīng)的腎上腺素能受體，OA調(diào)節(jié)了目前研究的無脊椎動(dòng)物幾乎所有的生理過程[1]，包括周圍器官、感覺器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的過程。OA也是人體內(nèi)源性的生物胺，在人體內(nèi)有重要的生理作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，OA是一種天然的β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑[3]，它可作為食品和保健食品的原料或者臨床藥物的輔助制劑，也可以單獨(dú)或與其它材料聯(lián)合使用，用于減肥和治療糖尿病[4-5]。在無脊椎動(dòng)物的各種組織中都發(fā)現(xiàn)OA的存在[6]，且含量較高。

魚露中章魚胺的含量相對(duì)豐富，約為0.06 %～0.1 %[7]，是天然章魚胺的主要來源。章魚胺含量測(cè)定的方法有光纖LED誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)法、放射酶學(xué)測(cè)定法、柱前衍生-RP-HPLC方法、毛細(xì)管氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜法[8-13]等。榮艷萍[7]等采用高效液相色譜法測(cè)得鳀魚魚露和七星魚魚露中章魚胺含量分別為1055 μg/mL和566 μg/mL。曲映紅[14]以智利外海莖柔魚內(nèi)臟為原料發(fā)酵魚露，測(cè)得魚露中的章魚胺含量高達(dá)4.5 mg/mL。

牛磺酸(taurine)，又稱β-氨基乙磺酸，因?yàn)樽钤缡菑呐｜S中分離出來的，所以取名牛磺酸。是一種存在于動(dòng)物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊游離氨基酸，是一種半必需氨基酸，在動(dòng)物體內(nèi)的各個(gè)組織和器官中含量最為豐富[15]，對(duì)于維持體內(nèi)組織細(xì)胞的穩(wěn)定具有重要的意義。另外，還有少量的牛磺酸以小肽和乙酰化的形式存在，這些短肽在體內(nèi)同樣有重要的作用。合成牛磺酸的半胱氨酸亞硫酸羧酶(CSAD)在人體內(nèi)活性較低，所以人體需要攝取食物中的牛磺酸來滿足自身的需要。牛磺酸作為一種神經(jīng)遞質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑等作用已被研究。研究表明，牛磺酸有調(diào)節(jié)滲透壓、抗氧化[16]、神經(jīng)傳導(dǎo)、免疫等作用，是良好的護(hù)肝劑，具有增強(qiáng)視力、促進(jìn)大腦發(fā)育、解除疲勞的作用，還具有一定的抗腫瘤活性[17-21]。同時(shí)，牛磺酸還被作為強(qiáng)化營養(yǎng)的食品添加劑添加入嬰幼兒奶粉中[22]。隨著人們對(duì)牛磺酸功能的不斷探索和認(rèn)識(shí)，天然牛磺酸的市場(chǎng)潛力不斷擴(kuò)大。

水產(chǎn)品中牛磺酸的含量十分豐富，尤其是在軟體動(dòng)物中[23]。牛磺酸也是魚露的重要成分。目前國內(nèi)外測(cè)定牛磺酸的方法有中和滴定法、高壓液相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析法、薄層層析法和分光光度計(jì)法等[24-25]。高效液相色譜法有樣品處理簡(jiǎn)單、方法精確度、靈敏度高和測(cè)定速度快等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于測(cè)定牛磺酸。

牛磺酸和章魚胺對(duì)人體來說都是必不可少的，而魚露中同時(shí)含有章魚胺和牛磺酸，因此本研究在于尋找一種方便、快捷的方法同時(shí)檢測(cè)魚露中的章魚胺和牛磺酸的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚內(nèi)臟：從南昌市鄱陽湖農(nóng)牧漁產(chǎn)業(yè)發(fā)展股份有限公司取回，置于-20℃冰柜凍存，使用前在10℃以下用流水解凍；鰻魚內(nèi)臟：江西東海食品有限公司，-20℃凍存，使用前在10℃以下用流水解凍；實(shí)驗(yàn)室利用魚內(nèi)臟自行發(fā)酵制備魚露，所有魚露樣品4℃保存；醬油種曲：北京食品釀造研究所，4℃保存；NaH2PO4(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈(色譜純)，2，4-二硝基氟苯(分析純)，章魚胺鹽酸鹽(≥98%)，牛磺酸(≥99%)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀,美國安捷倫；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州市萬豐儀器制造有限公司；0.45 μm水系微孔濾膜，0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；DELTA- 320型精密pH計(jì) METTLER TOLEDO公司；UT-12型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HA-300MD型高壓滅菌鍋,Hirayama Manufacturing Corporation；TDL-5A型臺(tái)式低速離心機(jī),上海菲恰爾分析儀器有限公司；SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚露的制備

參照周敏等[26]的方法，將草魚和鰻魚的內(nèi)臟經(jīng)分段加鹽、低鹽速釀的方法發(fā)酵制備魚露。取發(fā)酵第0、5、10、15、20、25、30天的樣品以及成品魚露為樣品，所有樣品4 ℃冰箱保存，進(jìn)行章魚胺和牛磺酸含量的測(cè)定。

1.3.2 檢測(cè)分析

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/L的NaH2PO4溶液(40∶60)，pH 7.5，流速為1.0 mol/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

(1)取25 mL棕色容量瓶，加入稱取的0.025 0 g牛磺酸和章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容，制備濃度為1 mg/mL的牛磺酸、章魚胺標(biāo)準(zhǔn)混合液。

(2)將1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)混合液置于10 mL的容量瓶中，加入1.5 mL濃度為10 mol/L的氨水溶液，再加入0.65 %的2.4-二硝基氟苯乙腈溶液2 mL，混勻室溫靜置5 min。在57 ℃水浴加熱10 min，加入pH 7.5的磷酸鹽溶液定容，得到0.1 mg/mL的牛磺酸、章魚胺衍生標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。將0.1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH7.5的磷酸鹽溶液稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.08 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10 μL，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。以混合物衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。本試驗(yàn)所有樣品放4 ℃冰箱冷藏保存，有效期7 d。

1.3.2.3 樣品的制備

稱0.0100 g的樣品，用超純水溶于10 mL的容量瓶中混勻并定容。吸取此樣品溶液0.1 mL于10的容量瓶中，同1.3.2.2(2)進(jìn)行衍生處理。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析與作圖

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每個(gè)試驗(yàn)平行4次。采用SPSS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析(ANOVA)檢查各個(gè)結(jié)果的顯著性差異，同時(shí)采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合物衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液中牛磺酸及章魚胺高效液相色譜保留時(shí)間

取1.3.2.2(2)中的混合物衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行液相測(cè)定，得到章魚胺及牛磺酸衍生物色譜圖如圖1所示，可以確定標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的出峰時(shí)間。牛磺酸衍生物的出峰時(shí)間是在1.89 min，章魚胺衍生物的出峰時(shí)間是在7.72 min。圖2為樣品溶液中章魚胺和牛磺酸衍生物色譜圖，對(duì)樣品用同樣的方法衍生處理、測(cè)定，色譜圖中相同時(shí)間點(diǎn)的出峰物質(zhì)即為樣品中的章魚胺和牛磺酸衍生物，由此計(jì)算樣品中章魚胺和牛磺酸的含量。

a-牛磺酸;b-章魚胺

圖2 樣品溶液中章魚胺和牛磺酸衍生物色譜圖

2.2 牛磺酸和章魚胺衍生的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液線性關(guān)系

按照色譜條件對(duì)牛磺酸和章魚胺衍生的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)得的峰面積與樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。章魚胺的質(zhì)量濃度在0.01～0.1 mg/mL時(shí)與峰面積呈良好的關(guān)系，線性回歸方程為y=219 812x-1 428.9，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6；牛磺酸的質(zhì)量濃度在0.03～0.1 mg/mL時(shí)與峰面積呈良好的關(guān)系，線性回歸方程為y=23 860x-202.42，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 9。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取樣品，按上述色譜條件分別在衍生后放置0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積的值，結(jié)果如表1所示。樣品在放置的時(shí)間段內(nèi)，其測(cè)得的峰面積變化越小，說明樣品越穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。章魚胺峰面積RSD=0.053 %(n=6)，牛磺酸峰面積RSD=0.027 %(n=6)。結(jié)果分析可知，樣品衍生后在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=6)

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取衍生后的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積的值，結(jié)果如表2所示。同種樣品按照固定的條件進(jìn)樣檢測(cè)，得到的結(jié)果越接近，說明儀器的精密度越好，測(cè)得的試驗(yàn)結(jié)果越精準(zhǔn)。章魚胺峰面積平均值為23 566，RSD=0.035%(n=6)；牛磺酸峰面積平均值為2 154.14，RSD=0.012%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)(n=6)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同樣的樣品六份，按照1.3進(jìn)行樣品制備、衍生，相同的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。同樣的樣品進(jìn)行衍生處理后，如果測(cè)得出峰面積相差不大，說明本試驗(yàn)在操作過程中出現(xiàn)的誤差比較小，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。樣品中章魚胺的峰面積平均值為33 143，RSD=1.339 %(n=6)；牛磺酸峰面積平均值669.64，RSD =0.013 %(n=6)。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

吸取已知含量的樣品溶液0.2 mL，再向其中加入0.8 mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行衍生化處理，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算回收率， 重復(fù)測(cè)定5次，加標(biāo)回收率結(jié)果如表4所示，章魚胺的平均回收率為99.23%，RSD =0.044%(n=5)；牛磺酸的平均回收率為97.67%，RSD =0.038%(n=5)。使用高效液相色譜法測(cè)定魚露中章魚胺和牛磺酸的含量具有很好的適用性和可行性。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 魚露樣品中章魚胺和牛磺酸含量的測(cè)定

取發(fā)酵過程中第0、5、10、15、20、25、30天以及第34 d制備的成品魚露，測(cè)定章魚胺和牛磺酸的含量。發(fā)酵過程中，章魚胺含量的變化趨勢(shì)如圖3所示，從總體上看，鰻魚發(fā)酵章魚胺的含量稍高于草魚魚露。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期章魚胺的含量逐漸增加，發(fā)酵后期章魚胺的含量有所下降，由于魚露的發(fā)酵是由多種酶共同作用的結(jié)果，后期含量的下降可能是因?yàn)檎卖~胺被降解為扁桃酸衍生物所引起的。發(fā)酵34 d制備的成品魚露，草魚魚露中章魚胺的含量為(6.53±0.12)mg/mL，鰻魚魚露中章魚胺的含量為(7.49±0.08)mg/mL。

牛磺酸的含量變化如圖4所示。在發(fā)酵的整個(gè)過程中，牛磺酸的含量基本保持不變，但草魚魚露中牛磺酸的含量顯著高于鰻魚魚露。發(fā)酵成品草魚魚露牛磺酸的含量為(14.29±0.38)mg/mL，鰻魚魚露中牛磺酸的含量為(1.21±0.24)mg/mL。牛磺酸的含量不發(fā)生變化是因?yàn)樵诎l(fā)酵的過程中牛磺酸不參與發(fā)酵反應(yīng)，成品魚露中牛磺酸的含量為原料中原本所含有的牛磺酸的含量。

圖3 發(fā)酵過程中章魚胺含量的變化

圖4 發(fā)酵過程中牛磺酸含量的變化

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC測(cè)定章魚胺和牛磺酸含量的方法，并研究了魚露發(fā)酵過程中章魚胺和牛磺酸含的變化趨勢(shì)。與之前的檢測(cè)方法相比，該方法可以實(shí)現(xiàn)這兩種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)，而且與以往單一的測(cè)定方法相比較，準(zhǔn)確度有所提高。色譜條件為：色譜柱：SunFireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)， 柱溫35 ℃，以0.02 mol/L的NaH2PO4為流動(dòng)相，pH調(diào)為7.5，流速為1.0 mol/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量10 μL。魚露發(fā)酵過程中章魚胺含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，牛磺酸的含量基本不發(fā)生變化。發(fā)酵成品魚露中，草魚魚露章魚胺的含量為(6.53±0.12)mg/mL，鰻魚魚露中章魚胺的含量為(7.49±0.08)mg/mL，草魚魚露牛磺酸的含量為(14.29±0.38)mg/mL，鰻魚魚露中牛磺酸的含量為(1.21±0.24)mg/mL。